若干大黃魚性腺發(fā)育相關基因的克隆與表達.pdf

1、以大黃魚（Larimichthys crocea）性腺為材料，采用SMART（switching mechanism at 5’end of RNA transcript）技術和DSN(duplex-specific nuclease）處理構建了大黃魚性腺線性化Cdna文庫，并從文庫中隨機挑取了3961個克隆進行測序，共獲得3535條高質量的表達序列標簽（Expressed Sequence Tag，EST）。序列經聚類分析后共得到29

2、16條Unigene，包括415條contigs和2501條singletons。初步分析結果表明：該線性化文庫的庫容為4.3×106pfu/Ml，文庫重組率達95.8％，EST的非冗余率為82.49％，Unigene的平均長度為355 bp。經生物信息學分析，1785個為已知基因占總ESTs的61.21％；其中與性腺發(fā)育相關的基因66個，占已知基因的3.70％。微衛(wèi)星分析發(fā)現共有129條EST序列含有149個微衛(wèi)星重復序列，包括6條與

3、性腺發(fā)育相關的ESTs。利用實時熒光定量PCR（Qrt-PCR）技術分析了11個與性腺發(fā)育相關基因在大黃魚性腺的表達情況。結果顯示精巢特異性LRR基因（testis-specific LRR）只在大黃魚精巢中表達（P<0.05）；雄性特異性致死3樣1基因（MSL3L1），雄激素相互作用受體核蛋白激酶基因（ARINPK），精子發(fā)生凋亡相關蛋白基因（SARP），熱休克蛋白70（HSP70）和細胞周期蛋白A1基因（cyclin A1）在精巢中

4、的表達量高于卵巢（P<0.05）；相反，組織蛋白酶C基因（Cathepsin C），核自身抗原精蛋白基因（NASP）和細胞周期蛋白B1（cyclin B1）在卵巢中的表達量高于精巢（P<0.05）；促分裂原激活蛋白激酶1（MAPK1）和泛素C末端水解酶L5（UCH-L5）在精巢和卵巢中表達沒有顯著差異（P>0.05）。
　　 在上述結果的基礎上，利用SMART-RACE技術或RT-PCR技術克隆了大黃魚性腺發(fā)育相關基因cyp19

5、a、cyp19b、cyclin B1、CDC2、UBE2D和UBC9全長Cdna序列，其長度分別為1805 bp、2268 bp、1882 bp、1151 bp、798 bp和846 bp，可分別編碼518、500、397、303、147和148個氨基酸的前體蛋白。利用Qrt-PCR技術分析這些基因在大黃魚各器官的表達情況，結果顯示：cyp19a在卵巢中的表達量顯著高于精巢（P<0.01），且cyp19a在精巢和卵巢中的表達均極顯著高于

6、其它各器官（P<0.01）；cyp19b在端腦、中腦、下丘腦、脾和肝有較高表達量，在雄性大黃魚的血中表達量最高。在性腺表達量極低。Cyclin B1和CDC2基因在性腺中的表達量極顯著高于其它各器官（P<0.01），且在卵巢中的表達量較精巢高（P<0.05）。UBE2D在脾臟和性腺中表達量較高，其它器官表達量較低，在性腺中的表達極顯著高于其它各器官（除脾臟外）（P<0.01）。UBC9在性腺中表達量較高，且極顯著高于其它各器官（P<0.