次郎柿與上西早生柿ACC氧化酶的轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、本研究以次郎柿與上西早生柿兩種甜柿組培苗葉片為外植體，通過(guò)對(duì)抗生素篩選條件和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)次郎柿與上西早生柿遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，建立了次郎柿與上西早生柿遺傳轉(zhuǎn)化體系，將ACC氧化酶的RNAi基因?qū)氪卫墒僚c上西早生柿組培苗中，以期通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法抑制ACC氧化酶的表達(dá)，提高躍變型果實(shí)的耐貯性能。主要取得以下研究結(jié)果: 1.次郎柿轉(zhuǎn)基因體系的建立 1.1研究了抗生素對(duì)葉片再生的影響，確定了適宜的抗生素濃度。 通過(guò)次

2、郎柿葉片及組培苗對(duì)抗生素的敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明:在抗性苗生長(zhǎng)過(guò)程中，用200mg/L頭孢霉素和30mg/L壯觀霉素做為篩選轉(zhuǎn)化抗性苗的篩選濃度。 1.2次郎柿轉(zhuǎn)基因工藝路線采用繼代四年半的組培苗，取其頂端2～3片剛展開(kāi)的嫩葉，從葉基部剪取4mm×4mm大小的葉片，葉背朝上，接種在DKW(1/2N)+ZT1.0mg/L+TDZ0.5mg/L的培養(yǎng)基上:暗預(yù)培養(yǎng)4d后，用OD600值為0.5的菌液濃度侵染葉片lOmin，侵染時(shí)加入5

3、0mg/L的乙酰丁香酮。將侵染后的葉片外植體，再轉(zhuǎn)到DKW(1/2N)+ZT1.0mg/L+TDZ0.5mg/L，的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d，之后移入DKW(1/2N)+ZT1.0 mg/L+TDZ0.5mg/L+Cef200mg/L的培養(yǎng)基上黑暗脫菌培養(yǎng)3d;最后轉(zhuǎn)入DKW(1/2N)+ZT1.0mg/L+TDZ0.5mg/L+Cef200mg/L+Sp30mg/L的培養(yǎng)基上光照選擇培養(yǎng)，每25d繼代一次。繼代7～8次后轉(zhuǎn)入DKW+ZT1.

4、0mg/L+Sp30mg/L+Cef200mg/L的培養(yǎng)基中。獲得了次郎柿ACC氧化酶的RNAi轉(zhuǎn)基因苗。經(jīng)GUS染色及PCR檢測(cè)得到27株轉(zhuǎn)基因植株。 2.上西早生柿轉(zhuǎn)基因體系的建立 2.1研究了抗生素對(duì)葉片再生的影響，確定了適宜的抗生素濃度。 通過(guò)上西早生柿葉片及組培苗對(duì)抗生素的敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明:在抗性苗生長(zhǎng)過(guò)程中，用200mg/L頭孢霉素和30mg/L，壯觀霉素做為篩選轉(zhuǎn)化抗性苗的篩選濃度。 2

5、.2上西早生柿轉(zhuǎn)基因工藝路線采用繼代四年半的組培苗，取其頂端2～3片剛展開(kāi)的嫩葉，從葉基部剪取4mm×4mm大小的葉片，葉背朝上，接種在DKW(1/2N)+ZT1.0mg/L+TDZ0.5mg/L的培養(yǎng)基上；暗預(yù)培養(yǎng)3d后，用OD600值為0.3的菌液濃度侵染葉片10min，侵染時(shí)加入100mg/L的乙酰丁香酮。將侵染后的葉片外植體，再轉(zhuǎn)到DKW(1/2N)+ZT1.0mg/L+TDZ0.5mg/L的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)4d，之后移入DKW(

6、1/2N)+ZT1.0mg/L+TDZ0.5mg/L+Cef200mg/L的培養(yǎng)基上黑暗脫菌培養(yǎng)3d；最后轉(zhuǎn)入DKw(1/2N)+ZT1.0mg/L+TDZ0.5mg/l+Cef200mg/L+Sp30mg/l的培養(yǎng)基上光照選擇培養(yǎng)，每25d繼代一次。繼代7～8次后轉(zhuǎn)入DKW+ZT1.0mg/L+Sp30mg/l+Cef200mg/L的培養(yǎng)基中。獲得了上西早生柿ACC氧化酶的RNAi基因轉(zhuǎn)基因苗。經(jīng)GUS染色及PCR檢測(cè)得到4株轉(zhuǎn)基因植