柿果ACC氧化酶基因cDNA克隆及其植物表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、柿果屬于躍變型果實(shí)，采收后極易軟化，給柿果的貯藏運(yùn)輸帶來(lái)不便。大量研究證實(shí)，乙烯是躍變型成熟果實(shí)的催熟激素。躍變型果實(shí)中自我催化的乙烯合成反應(yīng)啟始后，合成大量乙烯。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)抑制或降低果實(shí)乙烯的生物合成，可以降低果實(shí)乙烯的含量。ACC合成酶和ACC氧化酶是果實(shí)乙烯生物合成的限速酶，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法抑制這兩種酶的表達(dá)，可望提高躍變型果實(shí)的耐貯性能。本研究以柿果實(shí)為材料，克隆分離了富有柿ACC氧化酶基因，成功構(gòu)建了該基因的反義和RNA干

2、擾表達(dá)載體，結(jié)果如下： 1．利用Rneasy Plant Mini Kit試劑盒成功提取了高質(zhì)量的RNA，RNA的OD<,260>/OD<,280>比值為2.0979，為mRNA的反轉(zhuǎn)錄奠定了基礎(chǔ)。 2．mRNA的反轉(zhuǎn)錄采用了QIAGEN公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Omniscript<'TM>RTKit)，分離到完整性好的mRNA，為繼后的RT-PCR提供可靠保證。 3．根據(jù)已發(fā)表的平核無(wú)柿ACC氧化酶的保守氨基酸序列

3、，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到一個(gè)長(zhǎng)592bp的cDNA片段，經(jīng)序列分析證明該片段具有ACC氧化酶的保守區(qū)氨基酸序列，與GenBank中平核無(wú)柿果的DK-AC01基因核苷酸序列及所編碼的氨基酸序列同源性達(dá)98％，說(shuō)明克隆到的片段是富有柿果ACC氧化酶基因片段。 4．通過(guò)分析已獲得ACC氧化酶基因片段，在內(nèi)含子兩端分別設(shè)計(jì)含有EcoRV酶切位點(diǎn)的引物，通過(guò)酶切將兩個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接成一條基因片段，并轉(zhuǎn)化到大腸

4、桿菌DH5a中經(jīng)過(guò)鑒定及測(cè)序，證明得到了去除內(nèi)含子的基因片段。 5．用限制性?xún)?nèi)切酶Xba Ⅰ和BamH Ⅰ酶切克隆到的富有柿果ACC氧化酶核苷酸序列和pBI221質(zhì)粒載體，將ACC氧化酶的序列反向克隆到了pBI221質(zhì)粒中，構(gòu)建成中間表達(dá)載體pBI-anti-ACO。 6．用Sma Ⅰ和HindⅢ酶切構(gòu)建好的中間載體pBI-anti-ACO和pSMAK311質(zhì)粒，切下中間載體質(zhì)粒上的CaMV 35S啟動(dòng)子和ACO的反義序

5、列，將其插入到切除CaMV 35S啟動(dòng)子的pSMAK311質(zhì)粒中，構(gòu)建成反義表達(dá)載體pSMAK-anti-ACO。 7．用BamH Ⅰ和Sma Ⅰ分別酶切反義中間表達(dá)載體質(zhì)粒pBI-anti-ACO和富有柿果ACC氧化酶核苷酸序列，將ACC氧化酶的序列正向插入到中間載體pBI-anti-ACO質(zhì)粒中，構(gòu)建成中間表達(dá)載體pBI-ACO-RNAi。 8．用Sma Ⅰ和HindⅢ酶切構(gòu)建好的中間載體pBI-ACO-RNAi和p