次郎柿ACC合成酶轉(zhuǎn)基因及生根移栽體系的研究.pdf

1、柿子是我國的大眾水果，占世界總產(chǎn)量70％以上，其營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，具有很高的食用價(jià)值及醫(yī)療保健價(jià)值，但不耐貯藏。本論文利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將1-氨基-1-羧基環(huán)丙烷(ACC)合成酶的RNAi基因?qū)肓舜卫墒林?，有望在今后幾年獲得抗軟化的柿果。 1、次郎柿轉(zhuǎn)基因體系的建立 以次郎柿組培苗葉片為外植體，較系統(tǒng)地研究了次郎柿轉(zhuǎn)基因的工藝條件。研究結(jié)果： 1.1 確定了適宜的抗生素濃度。 比較了不同(具體濃度)頭孢

2、霉素濃度抑菌效果，其中200 mg/L頭孢霉素可以抑制農(nóng)桿菌的繁殖。比較20、30、40、50、60 mg/L壯觀霉素對(duì)不定芽生長的情況，選擇出了適宜的壯觀霉素為30 mg/L。 1.2次郎柿轉(zhuǎn)基因工藝路線 采用繼代三年半的組培苗，取其頂端2-3片剛展開的嫩葉，從葉基部剪取0.5 mm<'2>大小的葉片，葉背朝上，接種在DKW(1/2N)+ZT 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L的培養(yǎng)基上；暗預(yù)培養(yǎng)4 d后，用O

3、D<,600>0.5的菌液濃度侵染葉片10 min，侵染時(shí)加入50 mg/L的乙酰丁香酮。將侵染后的葉片外植體，再轉(zhuǎn)到DKW(1/2N)+ZT’1.0 mg/L+TDZ 0.5mg/L的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d，之后移入DKW(1/2N)+ZT 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/／L+Cef 200 mg／L的培養(yǎng)基上黑暗脫菌培養(yǎng)3 d；最后轉(zhuǎn)入DKW(1/2N)+ZT 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+Cef200 mg/

4、L+Sp 30 mg/L的培養(yǎng)基上光照選擇培養(yǎng)，每20 d繼代一次。繼代3次后轉(zhuǎn)入DKW+ZT 1.0 mg/L+Sp 30 mg/L+Cef 200 mg/L的培養(yǎng)基中。葉片分化率最高可達(dá)27％。獲得了次郎柿ACC合成酶的RNAi基因轉(zhuǎn)基因苗。經(jīng)PCR檢測得到8株轉(zhuǎn)基因植株，占再生芽的1.6。 2、次郎柿組培苗生根移栽體系的確定 2.1選取在DKW+ZT 1.0 mg/L培養(yǎng)基中，高15-25 mm的、生長健壯的組培苗

5、為外植體，留頂端2-3片展開的嫩葉，接種在1/2 MS+IBA 1.0 mg/L的培養(yǎng)基(蔗糖濃度20g/L)中，暗培養(yǎng)7 d后，光照36/μmol/m<'2>s培養(yǎng)30 d。在此條件下，次郎柿組培苗韻生根率達(dá)到95％以上，不定根條數(shù)為4.8。 2.2生根苗在180μmol/m<'2>s的光照條件下，煉苗7 d；將苗小心取出，洗凈、消毒，栽入高溫滅菌過的蛭石中。移栽時(shí)空氣相對(duì)濕度控制在90％以上，溫度為25℃，光照強(qiáng)度為180μ