CGRP通過VEGF受體-2調(diào)節(jié)MG-63細(xì)胞增殖、遷移和collagenI表達(dá).pdf

1、 降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是一種新型的內(nèi)源性生物活性神經(jīng)多肽,廣泛分布于骨組織中。研究表明 CGRP 通過促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、遷移和骨形成在骨折愈合中發(fā)揮關(guān)鍵作用,但其機(jī)制尚不明確。在內(nèi)皮細(xì)胞中,CGRP可以通過提高VEGF、VEGF受體-2表達(dá)來增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,從而促進(jìn)的血管形成。而據(jù)報(bào)道,在MG-63細(xì)胞中VEGF受體-2磷酸化升高可以明顯提高M(jìn)G-63細(xì)胞的存

2、活率。VEGF-VEGFR系統(tǒng)在成骨細(xì)胞分化也發(fā)揮了重要作用。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示,在MG-63細(xì)胞中,CGRP可以提高VEGF受體-2表達(dá)。因此,可以推測CGRP可能通過VEGFR調(diào)控骨折愈合。
目的：
構(gòu)建VEGF受體-2干擾慢病毒載體,研究CGRP對VEGF受體-2干擾前后的MG-63增殖、遷移、VEGF受體-2表達(dá)及成骨標(biāo)記collagenI 表達(dá),探討 VEGF 受體-2 在CGRP調(diào)控MG-63細(xì)胞增殖

3、、遷移及骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)變化中的作用。
方法：
1.將CGRP 配成濃度分別為10-7、10-8、10-9、10-10mol/L的培養(yǎng)液,MG-63細(xì)胞在上述CGRP 培養(yǎng)液下作用5天后,采用Western bloting 檢測細(xì)胞中VEGF受體-2蛋白表達(dá)情況。初步探索CGRP對MG-63細(xì)胞VEGF受體-2表達(dá)的影響,并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取合適的CGRP濃度提供基礎(chǔ)。
2.摘取文獻(xiàn)報(bào)道的VEGF

4、受體-2干擾siRNA序列,利用Western bloting驗(yàn)證干擾效果,將它構(gòu)建到慢病毒載體中,通過PCR鑒定陽性克隆,并通過測序鑒定篩選出的陽性克隆。在293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝,純化、滴度測定。
3.將MG-63細(xì)胞接種到96孔板中,按MOI=30、60、100進(jìn)行慢病毒感染預(yù)實(shí)驗(yàn)。
4.將VEGFR-2干擾后的MG-63細(xì)胞接種到6孔板,并在CGRP 10-7mol/L下培養(yǎng),利用Western b

5、loting實(shí)驗(yàn)檢測VEGFR-2蛋白表達(dá)。
5.將VEGFR-2干擾后的MG-63細(xì)胞接種到96孔板,并在CGRP 10-7mol/L下培養(yǎng),利用 MTT實(shí)驗(yàn)檢測1、2、3、4天OD值。
6.將VEGFR-2干擾后的MG-63細(xì)胞接種到 24孔板,并在CGRP 10-7mol/L下培養(yǎng),進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn),48h后進(jìn)行穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)。
7.將VEGFR-2干擾后的MG-63細(xì)胞接種到6孔

6、板,并在CGRP 10-7mol/L下培養(yǎng),利用Western bloting檢測collagenI的蛋白表達(dá)。
結(jié)果：
1.隨著CGRP濃度的升高,MG-63細(xì)胞中VEGFR-2總蛋白的表達(dá)也提高。CGRP濃度在10-7mol/L時(shí)對VEGFR-2總蛋白的表達(dá)提高最明顯。
2.VEGFR-2干擾靶點(diǎn)的干擾效果有70%左右,說明干擾靶點(diǎn)有明顯的干擾效果。
3.通過PCR陽性克隆鑒定

7、和測序證明構(gòu)建的腺病毒表達(dá)質(zhì)粒完全正確。通過試劑盒測定對照慢病毒滴度是6×108TU/mL,VEGFR-2 干擾病毒的滴度是2×108TU/mL。4.熒光顯微鏡觀察顯示,VEGFR-2干擾慢病毒在MOI=100時(shí)感染MG-63細(xì)胞效果較好,感染效率可達(dá)90%,因此以MOI=100感染細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
5. MG-63細(xì)胞、MG-63細(xì)胞+干擾對照病毒、MG-63細(xì)胞+VEGFR-2干擾病毒三組細(xì)胞經(jīng)CGRP作用后VEGF

8、R-2的相對表達(dá)量為1.30、1.23、0.53。MG-63+VEGFR-2干擾病毒組與MG-63細(xì)胞+干擾對照病毒組VEGFR-2的相對表達(dá)量相比明顯降低,且差異明顯(p<0.05)。
6.隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,MG-63+CGRP組與MG-63組細(xì)胞相比增殖速度加快,且有明顯差異；MG-63+VEGFR-2 干擾+CGRP 組與 MG-63+對照病毒+CGRP 組細(xì)胞相比增殖速度降低,且有明顯差異。
7.M

9、G-63+VEGFR-2干擾+CGRP組與MG-63+對照病毒+CGRP組相比侵襲能力明顯降低,且差異非常顯著(p<0.01),MG-63+CGRP組細(xì)胞與MG-63組細(xì)胞相比明顯升高,且差異非常顯著(p<0.01)。
8.MG-63+VEGFR-2干擾+CGRP組與MG-63+對照病毒+CGRP組相比中collagenI蛋白的表達(dá)明顯降低,且差異顯著(p<0.05),MG-63+CGRP 組細(xì)胞與 MG-63 組細(xì)胞中c