體外轉染PTEN基因對人骨肉瘤細胞系MG-63增殖影響.pdf

1、目的：PTEN是近年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其編碼的磷酸酶可以拮抗三磷酸酰肌醇激酶途徑從而影響細胞的生長。雖然其抗腫瘤作用在很多腫瘤中都已經(jīng)被證實，但在骨肉瘤中的具體作用目前尚不清楚。本實驗采用脂質體法將PTEN導入人骨肉瘤MG-63細胞，觀察外源性PTEN基因穩(wěn)定轉染對人骨肉瘤MG-63細胞增殖的影響，初步探討其作用機制。 方法：1.人骨肉瘤細胞株MG-63細胞購于中科院上海細胞庫；采用CaCl2法將PTEN基因導入大腸桿菌DH5 α

2、中擴增，使用柱離心式質粒抽提純化試劑盒提取質粒；應用陽離子脂質體將PTEN基因轉染MG-63細胞，G418篩選出PTEN基因成功轉入的陽性細胞克隆，進行培養(yǎng)。2.應用反轉錄-聚合酶鏈反應法(RT-PCR)，提取細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，對PTEN基因在MG-63細胞中mRNA表達進行檢測；采用免疫印跡法(Western blot)利用

3、針對PTEN氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測MG-63細胞PTEN基因蛋白的表達3.MTT分析法以活細胞代謝物還原劑P噻唑藍為基礎，利用酶標儀測定490 nm處的光密度OD值，反映PTEN轉染后MG-63細胞活細胞數(shù)；將細胞消化成單細胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板，每日取細胞進行計數(shù)，將數(shù)值轉為對數(shù)標記在坐標紙上，描繪出生長曲線，觀察細胞生長趨勢。4.流式細胞術采用FITC-Annexin V、PI雙染法，對PTEN轉染后MG-63細胞凋

4、亡率進行檢測并用流式細胞儀分析轉染后細胞周期分布的變化。5.熒光染色法和電鏡法對轉染后細胞進行形態(tài)學觀察。 結果：1.體外培養(yǎng)出骨肉瘤MG-63細胞，CaCl2法將PTEN基因導入大腸桿菌DH5 α中擴增提純；脂質體法將PTEN基因成功導入細胞中，G418篩選出PTEN基因成功轉入的陽性細胞克隆，進行培養(yǎng)。2.反轉錄-聚合酶鏈反應法從pCMV-Tag3B-PTEN轉染組陽性克隆細胞中擴增出約300 bpPTEN基因片段；免疫印跡

5、法電泳結果顯示一條分子量為55KD條帶，提示PTEN cDNA在細胞內(nèi)的整合并成功表達。3.未轉染組OD值為0.89±0.03，pcmv-Tag3B組OD值為0.86±0.03，pcmv-Tag3B-PTEN轉染組OD值為0.64±0.04。轉染組活細胞數(shù)明顯低于其他兩組，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示PTEN對體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細胞株細胞增殖具有抑制作用；生長曲線PTEN轉染組生長趨勢較對照組明顯變緩。4.流式細胞術示未轉染組凋亡

6、率為3.61±0.39，pcmv-Tag3B組凋亡率為3.90±0.64，轉染組凋亡率為22.00±1.53，轉染組凋亡率明顯高于其他兩組，有統(tǒng)計學意義。轉染組出現(xiàn)G1期阻滯，提示PTEN至少可以通過對骨肉瘤MG-63細胞進行周期阻滯抑制骨肉瘤細胞生長。5.Hoechst33258熒光染色法顯示PTEN轉染組大量細胞出現(xiàn)核固縮，染色質高度凝聚可見核裂解和凋亡小體；電鏡法觀察細胞超微結構，可見轉染后細胞細胞體積縮小，出現(xiàn)核固縮，線粒體稀少