體外轉(zhuǎn)染PTEN基因?qū)θ斯侨饬黾?xì)胞系MG-63增殖影響.pdf

1、目的：PTEN是近年發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其編碼的磷酸酶可以拮抗三磷酸酰肌醇激酶途徑從而影響細(xì)胞的生長。雖然其抗腫瘤作用在很多腫瘤中都已經(jīng)被證實，但在骨肉瘤中的具體作用目前尚不清楚。本實驗采用脂質(zhì)體法將PTEN導(dǎo)入人骨肉瘤MG-63細(xì)胞，觀察外源性PTEN基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的影響，初步探討其作用機(jī)制。 方法：1.人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞庫；采用CaCl2法將PTEN基因?qū)氪竽c桿菌DH5 α

2、中擴(kuò)增，使用柱離心式質(zhì)粒抽提純化試劑盒提取質(zhì)粒；應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體將PTEN基因轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞，G418篩選出PTEN基因成功轉(zhuǎn)入的陽性細(xì)胞克隆，進(jìn)行培養(yǎng)。2.應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)，提取細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PTEN基因在MG-63細(xì)胞中mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測；采用免疫印跡法(Western blot)利用

3、針對PTEN氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測MG-63細(xì)胞PTEN基因蛋白的表達(dá)3.MTT分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑P噻唑藍(lán)為基礎(chǔ)，利用酶標(biāo)儀測定490 nm處的光密度OD值，反映PTEN轉(zhuǎn)染后MG-63細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)；將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板，每日取細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，將數(shù)值轉(zhuǎn)為對數(shù)標(biāo)記在坐標(biāo)紙上，描繪出生長曲線，觀察細(xì)胞生長趨勢。4.流式細(xì)胞術(shù)采用FITC-Annexin V、PI雙染法，對PTEN轉(zhuǎn)染后MG-63細(xì)胞凋

4、亡率進(jìn)行檢測并用流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期分布的變化。5.熒光染色法和電鏡法對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。 結(jié)果：1.體外培養(yǎng)出骨肉瘤MG-63細(xì)胞，CaCl2法將PTEN基因?qū)氪竽c桿菌DH5 α中擴(kuò)增提純；脂質(zhì)體法將PTEN基因成功導(dǎo)入細(xì)胞中，G418篩選出PTEN基因成功轉(zhuǎn)入的陽性細(xì)胞克隆，進(jìn)行培養(yǎng)。2.反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法從pCMV-Tag3B-PTEN轉(zhuǎn)染組陽性克隆細(xì)胞中擴(kuò)增出約300 bpPTEN基因片段；免疫印跡

5、法電泳結(jié)果顯示一條分子量為55KD條帶，提示PTEN cDNA在細(xì)胞內(nèi)的整合并成功表達(dá)。3.未轉(zhuǎn)染組OD值為0.89±0.03，pcmv-Tag3B組OD值為0.86±0.03，pcmv-Tag3B-PTEN轉(zhuǎn)染組OD值為0.64±0.04。轉(zhuǎn)染組活細(xì)胞數(shù)明顯低于其他兩組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示PTEN對體外培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞株細(xì)胞增殖具有抑制作用；生長曲線PTEN轉(zhuǎn)染組生長趨勢較對照組明顯變緩。4.流式細(xì)胞術(shù)示未轉(zhuǎn)染組凋亡

6、率為3.61±0.39，pcmv-Tag3B組凋亡率為3.90±0.64，轉(zhuǎn)染組凋亡率為22.00±1.53，轉(zhuǎn)染組凋亡率明顯高于其他兩組，有統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)G1期阻滯，提示PTEN至少可以通過對骨肉瘤MG-63細(xì)胞進(jìn)行周期阻滯抑制骨肉瘤細(xì)胞生長。5.Hoechst33258熒光染色法顯示PTEN轉(zhuǎn)染組大量細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，染色質(zhì)高度凝聚可見核裂解和凋亡小體；電鏡法觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，可見轉(zhuǎn)染后細(xì)胞細(xì)胞體積縮小，出現(xiàn)核固縮，線粒體稀少