創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的表達(dá)及血必凈干預(yù).pdf

1、目的:
　　 探討創(chuàng)傷弧菌(Vv)膿毒癥大鼠肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2和9、組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)1的動(dòng)態(tài)表達(dá)及血必凈干預(yù)。
　　 方法:
　　 1.清潔級(jí)SD大鼠110只,雌雄各半,隨機(jī)分成11組,每組10只,雌雄各5只。1組:正常對(duì)照組(A組)。第2～6組:創(chuàng)傷弧菌膿毒癥組(B組),予左側(cè)下肢外側(cè)皮下注射Vv懸濁液,濃度為6×108cfu/ml,劑量為0.1ml/100g,構(gòu)建創(chuàng)傷弧菌膿毒癥模

2、型。該組大鼠分別在染菌后1h、6h、12h、24h、48h時(shí)活殺。第7～11組:Vv膿毒癥血必凈干預(yù)組(C組),予左側(cè)下肢外側(cè)皮下注射Vv懸濁液(濃度、劑量同B組)后0.5h始,予腹腔注射血必凈4ml/kg,每12h一次,分別在染菌后1h、6h、12h、24h、48h時(shí)活殺。無菌操作取部分肺組織于液氮中保存待用。
　　 2.觀察各組大鼠在體溫、呼吸、心跳、精神狀態(tài)等情況的改變,隨機(jī)取B組各時(shí)間點(diǎn)大鼠1只,無菌取血送檢血培養(yǎng)。

3、r>　　 3.RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠MMP2、MMP9、TIMP1的基因表達(dá)。瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像,Quanity One分析軟件分析,以(目的基因10D值/β-actin10D值)為表達(dá)校正值進(jìn)行比較。
　　 4.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MMP9蛋白表達(dá)及組織分布:鏈霉素-辣根過氧化物酶(SP)法檢測(cè),每組隨機(jī)取5張切片,每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野,×400鏡下拍照。
　　 5.ELISA法檢測(cè)TIMP1蛋白表達(dá):

4、100mg左肺組織:1ml生理鹽水組織勻漿,標(biāo)本稀釋倍數(shù)為1000,按說明書進(jìn)行。
　　 6.病理觀察:取材,固定,石蠟包埋,切片,HE染色、×200光鏡下拍照。
　　 7.超微結(jié)構(gòu)觀察:取0.1cm×0.1cm×0.1cm肺組織,固定,包埋,切片,光鏡定位,鈾-鉛雙重染色,H7500型透射電鏡觀察拍照。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示((x)±s),采用SPSS17.0分析,進(jìn)行單因素方差分

5、析、t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.B組染菌3h始,大鼠開始出現(xiàn)呼吸急促、體溫升高、注射下肢腫脹等癥狀,癥狀進(jìn)行性加重,染菌后12h出現(xiàn)明顯紫紺、下肢腫脹壞死、間斷抽搐等；C組大鼠在藥物干預(yù)后,上述癥狀發(fā)生較輕,注射下肢腫脹程度輕、無紫紺、無抽搐；B組12h、24h大鼠血培養(yǎng)可見創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)。
　　 2.A組大鼠肺組織MMP2mRNA表達(dá)較低(0.102±0.032),B組大鼠

6、染菌后1h(0.198±0.066)、6h(0.344±0.108)、12h(0.254±0.092)、24h(0.182±0.044)表達(dá)明顯升高(P<0.05),以染菌后6h為最高。C組6h(0.193±0.083)、12h(0.256±0.074)表達(dá)明顯高于正常(P<0.05),高峰在12h。C組與相同時(shí)間點(diǎn)B組相比,染菌后6h表達(dá)明顯降低(P<0.05)。
　　 3.A組大鼠肺組織MMP9mRNA表達(dá)極低C0.345±

7、0.109),B組大鼠染菌后1h(0.846±0.162)、6h(1.230±0.377)、12h(0.847±0.144)、24h(0.613±0.143)表達(dá)與A組相比,明顯升高(P<0.05),C組染菌后1h(0.603±0.085)、6h(0.968±0.225)表達(dá)明顯高于A組(P<0.05)。兩組表達(dá)趨勢(shì)相似,高峰均在染菌后6h。C組與相同時(shí)間點(diǎn)B組相比,1h、6h、12h肺組織MMP9mNA表達(dá)降低明顯(P<0.05)。<

8、br>　　 4.A組大鼠肺組織MMP9蛋白表達(dá)量極低(0.011±0.005),B組大鼠染菌后6h(0.034±0.011)、12h(0.061±0.017)、24h(0.035±0.018)、48h(0.023±0.017)表達(dá)明顯升高(P<0.05)。C組染菌后6h(0.034±0.009)、12h(0.045±0.013)、24h(0.026±0.014)、48h(0.021±0.008)表達(dá)高于正常(P<0.05)。兩組表達(dá)趨

9、勢(shì)相似,高峰均在染菌后12h。C組與相同時(shí)間點(diǎn)B組相比,12h、24h表達(dá)降低明顯(P<0.05)。
　　 5.A組大鼠肺組織TIMP1mRNA表達(dá)量極低(0.236±0.026),B組大鼠染菌后6h(0.427±0.189)、12h(0.523±0.098)、24h(0.463±0.117)表達(dá)明顯升高(P<0.05),C組染菌后6h(0.618±0.301)、12h(0.746±0.316)、24h(0.534±0.193)

10、表達(dá)明顯升高(P<0.05)。兩組表達(dá)趨勢(shì)相似,高峰均在染菌后12h。C組與相同時(shí)間點(diǎn)B組相比,6h、12h表達(dá)升高明顯(P<0.05)。
　　 6.A組大鼠肺組織TIMP1蛋白表達(dá)量低(629.30±110),B組大鼠染菌后12h(1141.09±117)、24h(1384.42±91)、48h(1271.90±173)表達(dá)明顯升高(P<0.05)。C組染菌后6h(999.19±104)、12h(1189.68±266)、24

11、h(1617.22±103)、48h(1280.36±118)表達(dá)高于正常(P<0.05)。兩組表達(dá)趨勢(shì)相似,高峰均在染菌后24h。C組與相同時(shí)間點(diǎn)B組相比,6h、24h表達(dá)升高明顯(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肺組織MMP2、MMP9表達(dá)在膿毒癥早期即達(dá)高峰,TIMP1于中晚期達(dá)高峰。
　　 2.使用血必凈可減低創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肺組織MMP2、MMP9表達(dá)、升高TIMP1基因表