酒精性肝病小鼠CD4+CD25+Foxp3Freg的初步研究.pdf

1、酒精性肝病(alcoholicliverdisease，ALD)系指長(zhǎng)期過量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病。通常初期表現(xiàn)為脂肪肝，繼續(xù)進(jìn)展成為酒精性肝炎(alcoholichepatitis，AH)、酒精性肝纖維化(alcoholichepaticfibrosis，AHF)和酒精性肝硬化(alcoholiccirrhosis，AC)。該病在西方國(guó)家發(fā)病率高，在國(guó)內(nèi)其發(fā)病率隨著酒精消耗量增加，嗜酒人群擴(kuò)大，亦逐年上升，已經(jīng)成為肝損害的重要病因。ALD

2、的致病因素是明確的，單一的，然而目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能涉及氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、線粒體損傷、金屬離子代謝紊亂、遺傳、營(yíng)養(yǎng)以及免疫學(xué)機(jī)制等諸多方面。由于嚙齒類動(dòng)物天生厭酒，建立符合人類飲酒習(xí)慣的ALD模型相對(duì)困難，尤其是單純的酒精刺激很難形成纖維化。因此建立良好的ALD的模型，探討其發(fā)病機(jī)制是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。
　　 肝臟不僅是一個(gè)代謝器官，而且是一免疫器官，包括天然免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，這兩大系統(tǒng)能精確調(diào)控內(nèi)源性和外源性

3、抗原免疫反應(yīng)，既能避免反應(yīng)過度導(dǎo)致自身免疫性疾病，又能防止有害病菌的入侵和感染。其中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcell，Treg)是誘導(dǎo)和維持抗原特異性T細(xì)胞耐受、防止自身反應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。CD4+CD25+Foxp3+Treg系一群不同于Th1、Th2和Th17的具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，具有很強(qiáng)的免疫抑制能力，可通過抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的活化和增殖來(lái)調(diào)節(jié)外來(lái)抗原或自身抗原的免疫應(yīng)答，維

4、持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)。CD4+CD25+Foxp3+Treg數(shù)量及功能的異常是多種自身免疫性疾病的重要的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)亦在多種肝病的發(fā)病中起重要作用。但是迄今為止尚無(wú)CD4+CD25+Foxp3+Treg與ALD的相關(guān)性研究。探討CD4+CD25+Foxp3+Treg在ALD中的作用機(jī)制為進(jìn)一步從免疫角度指導(dǎo)治療提供理論依據(jù)。
　　 目的:1、建立急、慢性ALD動(dòng)物模型。2、研究CD4+CD25+Foxp3+Treg與小鼠急、慢性AL

5、D的關(guān)系。
　　 方法:本實(shí)驗(yàn)采取隨機(jī)-對(duì)照的研究方法。實(shí)驗(yàn)分為慢性組及急性組兩部分，將SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分組。(1)①慢性組C57BL/6小鼠40只，自由飲服Lieber-DeCarli酒精液體對(duì)照飼料5天后，分為Control+CCL4組、Control+oliveoil組、Alcohol+CCL4組、Alcohol+oliveoil組各10只，分別予Lieber-DeCarli酒精液體飼料及其

6、對(duì)照飼料自由飲服8周;第9周開始予Control+CCL4組和Alcohol+CCL4組小鼠2.5％CCL44mL/kg腹腔注射，2次/周，同時(shí)予Control+oliveoil組和Alcohol+oliveoil組小鼠橄欖油4mL/kg腹腔注射，2次/周;第10周處死小鼠;②慢性組的研究顯示在酒精性脂肪肝和纖維化組中CD4+CD25+Foxp3+Treg變化趨勢(shì)一致，為了研究急性ALD中CD4+CD25+Foxp3+Treg的變化，故

7、設(shè)計(jì)了急性組，進(jìn)行相關(guān)性研究。C57BL/6小鼠20只，分為Control組、Alcohol組各10只，同樣的方法引入Lieber-DeCarli酒精液體飼料及對(duì)照飼料，自由飲服10天，第11天分別給予酒精或麥芽糖5g/kg灌胃，10小時(shí)后處死小鼠。(2)每天觀察小鼠精神狀態(tài)，毛發(fā)光澤度，進(jìn)食、行為情況等，每天記錄進(jìn)食量，每周測(cè)量小鼠體重。(3)觀察各組小鼠肝臟組織大體形態(tài)變化，記錄肝臟重量，計(jì)算比較肝重指數(shù)變化。(4)應(yīng)用蘇木素伊紅(

8、hematoxylinandeosin，HE)染色和苦味酸-天狼猩紅染色觀察肝臟病理組織學(xué)改變。(5)檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase，AST)、甘油三酯(triglyceride，TG)等變化。(6)分離肝臟及脾臟淋巴細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(fluorescenceactivatedcellsorting，F(xiàn)ACS)

9、檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例。(7)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timefluorescentquantitationPCR,Real-timeqPCR)方法檢測(cè)各組小鼠肝臟Foxp3mRNA、IL-2mRNA和TGF-βmRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　 結(jié)果:(1)①慢性組:Control+oliveoil和Control+CCL4組肝臟大小、質(zhì)地正常。Alcohol+oliveoil組小鼠肝臟外形飽滿，

10、顏色黃，表面紋理粗糙，切面油膩、脆。Alcohol+CCL4組上述變化更顯著。Alcohol+oliveoil和Alcohol+CCL4組的肝重指數(shù)較Control+oliveoil和Control+CCL4組增加，以Alcohol+CCL4組升高最為明顯，達(dá)6.33±0.47;Control+oliveoil組與Alcohol+CCL4和Alcohol+oliveoil組比較，P＜0.05;②急性組:Control組肝臟大小、質(zhì)地正常

11、。Alcohol組外形飽滿，色稍黃，切面不清晰;其肝重指數(shù)與Control組比較(4.50±0.90vs4.99±0.08，P＜0.05)。(2)肝臟組織病理學(xué)觀察，①慢性組:Control+oliveoil和Control+CCL4組肝細(xì)胞大小及排列正常;Alcohol+oliveoil組中央靜脈和小葉間靜脈周圍出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)疏松、水樣變等改變，可見小或中等空泡樣改變，胞核被擠向一邊，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);Alcohol+CCL4組

12、上述變化更加顯著，可見大量小或中等空泡樣改變，胞核被擠向一邊，可見片狀肝細(xì)胞壞死，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);在肝匯管區(qū)的動(dòng)靜脈及肝竇內(nèi)偶可見到血液瘀滯?？辔端?天狼猩紅染色顯示:Alcohol+CCL4組可見肝小葉紊亂，在中央靜脈周圍及匯管區(qū)可見纖維沉積增多，肝纖維化形成，而其他組只見小葉靜脈管壁纖維組織染色。膠原陽(yáng)性染色區(qū)域定量顯示:Alcohol+CCL4組高于Alcohol+oliveoil、Control+CCL4及Control+ol

13、iveoil組(0.03±0.00vs0.01±0.01，0.01±0.01，0.01±0.01，P＜0.05);②急性組:Alcohol+oliveoil組中央靜脈周圍出現(xiàn)少許肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)疏松，水樣變等改變，可見小或中等空泡樣改變，胞核被擠向一邊。(3)①慢性組ALT、AST和TG在各組中分別為Control+CCL4組34.76±3.90U/L、111.57±5.90U/L、0.59±0.06mmol/L,Control+oli

14、veoil組31.90±1.93U/L、99.61±4.88U/L、0.54±0.04mmol/L,Alcohol+CCL4組124.82±9.94U/L、205.18±14.86U/L、0.88±0.06mmol/L,Alcohol+oliveoil組195.11±3.64U/L、201.12±6.81U/L、0.76±0.06mmol/L;ALT、AST、TG在Alcohol+CCL4和Alcohol+oliveoil組中均顯著增高

15、，與Control+CCL4和Control+oliveoil組比較，P＜0.05;而Alcohol+CCL4組與Alcohol+oliveoil組之間比較，P＞0.05;②急性組ALT、AST和TG在Control組為31.14±2.26U/L、112.23±10.23U/L和0.52±0.06mmol/L,Alcohol組95.58±10.52U/L、220.40±13.41U/L和0.86±0.05mmol/L;ALT、AST、T

16、G在Alcohol組均顯著增高，與Control組比較，P＜0.05;(4)慢性組肝臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg比例在Control+CCL4、Control+oliveoil、Alcohol+CCL4及Alcohol+oliveoil組分別為6.45±1.17、4.78±0.84、12.35±0.82和10.21±1.61;Alcohol+CCL4和Alcohol+oliveoil組較Control+CCL4和Contr

17、ol+oliveoil組增高，且P＜0.05;而Alcohol+CCL4和Alcohol+oliveoil組之間以及Control+CCL4和Control+oliveoil組之間比較，P＞0.05。在脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg比例各組間比較，P＞0.05。(5)Real-timeqPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①慢性組肝臟組織中Foxp3mRNA相對(duì)表達(dá)量在Control+CCL4、Control+oliveoil、Alcohol

18、+CCL4及Alcohol+oliveoil組分別為1.25±0.16、0.95±0.07、3.17±0.77和2.91±0.28;Alcohol+CCL4和Alcohol+oliveoil組較Control+CCL4和Control+oliveoil組增高，且P＜0.05;而Alcohol+CCL4組與Alcohol+oliveoil組之間以及Control+CCL4組與Control+oliveoil組之間比較，P＞0.05。TGF

19、-βmRNA相對(duì)表達(dá)量在Control+CCL4、Control+oliveoil、Alcohol+CCL4及Alcohol+oliveoil組分別為1.81±0.57、1.49±0.23、2.99±0.30和1.78±0.15;Alcohol+CCL4組與其他組比較增高，P＜0.05;Alcohol+oliveoil組與Control+CCL4和Control+oliveoil組比較及Control+CCL4組與Control+oli

20、veoil組比較，P＞0.05。IL-2mRNA相對(duì)表達(dá)量在Control+CCL4、Control+oliveoil、Alcohol+CCL4及Alcohol+oliveoil組分別為1.00±0.11、0.70±0.25、2.61±0.70和2.21±0.26;Alcohol+CCL4較其他組增高，且P＜0.05;Alcohol+oliveoil組與Control+oliveoil組比較，P＜0.05;Control+CCL4組與C

21、ontrol+oliveoil組之間比較，P＞0.05;②急性組肝臟組織中Foxp3mRNA相對(duì)表達(dá)量在Control組與Alcohol組比較(4.93±0.32vs5.07±0.17,P＞0.05)。TGF-βmRNA相對(duì)表達(dá)量在Control組與Alcohol組比較(2.83±1.24vs7.80±0.66,P＜0.05)。IL-2mRNA相對(duì)表達(dá)量在Control組與Alcohol組(0.10±0.00vs0.08±0.21,P＞