發(fā)育早期鉛暴露致食蟹猴阿爾茨海默病樣作用及其對(duì)表觀遺傳修飾的影響.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種與年齡高度相關(guān)、進(jìn)行性發(fā)展的原發(fā)性神經(jīng)退行性疾病。盡管AD的發(fā)病機(jī)制至今不明，但眾多研究表明，β-淀粉樣蛋白(Amyloidβ-protein，Aβ)是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，是AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此，圍繞Aβ展開的對(duì)AD發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的各種影響因素及其調(diào)節(jié)機(jī)制的探討是當(dāng)今該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　 近年來(lái)，環(huán)境中低劑量鉛(Lead，Pb)暴露對(duì)人群健康的

2、影響已成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。發(fā)育期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)鉛的毒性尤為敏感，可導(dǎo)致兒童智力損害以及認(rèn)知和注意力等神經(jīng)功能障礙，而個(gè)體認(rèn)知功能下降與AD的病理改變存在一定的相關(guān)性?；诔扇思膊〉呐咛テ鹪醇僬f(shuō)，有學(xué)者提出AD存在早期起源的可能性，結(jié)合鉛在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中不可忽視的毒性效應(yīng)，本研究認(rèn)為鉛可能參與了個(gè)體AD樣變進(jìn)程。
　　 表觀遺傳(Epigenetics)是針對(duì)基因與環(huán)境相互作用所致基因表達(dá)變化的一個(gè)重要的適應(yīng)機(jī)制。多數(shù)學(xué)者認(rèn)

3、為AD是一種由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，已有證據(jù)提示表觀遺傳修飾異?？赡苁沁t發(fā)型AD發(fā)病的重要機(jī)制之一，因此本研究認(rèn)為環(huán)境鉛可能通過(guò)對(duì)表觀遺傳修飾的影響在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　 為驗(yàn)證上述假設(shè)，本研究運(yùn)用食蟹猴隊(duì)列研究并結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)，探討鉛在AD樣變進(jìn)程中的作用及可能的表觀遺傳修飾效應(yīng)，從而為進(jìn)行AD的病因及發(fā)病機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。
　　 目的：
　　 1.基于發(fā)育早期鉛暴露食

4、蟹猴模型，探討鉛暴露、表觀遺傳修飾在AD樣進(jìn)程中可能致病機(jī)制。
　　 2.通過(guò)構(gòu)建鉛暴露體外模型，探討鉛對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞可能的AD樣作用。評(píng)估鉛暴露對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞組蛋白乙酰化及甲基化修飾的影響。
　　 材料與方法：
　　 1.研究對(duì)象
　　 1.1 動(dòng)物模型：將剛出生的10只雌性食蟹猴隨機(jī)分為兩組進(jìn)行隊(duì)列研究。鉛暴露組(23PbE)：從幼猴出生之日至400日齡每天飲用含醋酸鉛的配方奶粉，劑量為1

5、.5 mg·kg-1·d-1。對(duì)照組(23CT)：從幼猴出生之日至400日齡每天飲用無(wú)鉛配方奶粉。兩組動(dòng)物斷乳后常規(guī)無(wú)鉛飲食飼養(yǎng)至23歲，分批次實(shí)施安樂(lè)死。另選擇雌性食蟹猴8只，從出生之日至400日齡每天給予無(wú)鉛配方奶粉飲食，自401日齡起斷乳并開始常規(guī)無(wú)鉛飲食飼養(yǎng)，于各取樣節(jié)點(diǎn)(3～6歲或12歲)分批次對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。分離雙側(cè)大腦皮層備用。
　　 1.2 細(xì)胞株：選用人源神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞株作為研究對(duì)象。

6、經(jīng)RA分化后，分別給予終濃度為5μM～100μM的醋酸鉛染毒。
　　 2.方法
　　 2.1 采用Western blot及免疫熒光分析技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組AD相關(guān)蛋白、DNA甲基化修飾、組蛋白乙?；凹谆揎椣嚓P(guān)蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)微陣列分析技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)生物相關(guān)基因的表達(dá)譜。
　　 2.2 采用實(shí)時(shí)定量PCR分析AβPP、NEP基因mRNA的表達(dá)，采用ELISA方法檢測(cè)醋酸鉛暴露對(duì)Aβ1-40表達(dá)的影響，并對(duì)NE

7、P活性進(jìn)行熒光測(cè)定。
　　 3.統(tǒng)計(jì)分析
　　 使用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析：兩組數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。兩組樣本間相關(guān)性比較采用Person相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.年齡及發(fā)育早期鉛暴露對(duì)食蟹猴AD相關(guān)蛋白、DNMT1、DNMT3a及MeCP2表達(dá)的影響隨著年

8、齡的增長(zhǎng)，食蟹猴皮層組織中AβPP蛋白水平逐漸升高。正常23歲齡組的表達(dá)高于3～6歲齡組及12歲齡組(P<0.01)。23PbE組AβPP蛋白表達(dá)水平高于23CT組(P<0.05)。隨著年齡的增長(zhǎng)，食蟹猴大腦皮層組織中NEP蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。正常12歲年齡組NEP蛋白的表達(dá)明顯高于3～6歲齡組及23歲齡組(P<0.01)。此外，23PbE組NEP蛋白表達(dá)水平低于23CT組(P<0.01)。
　　 隨著年齡的增長(zhǎng)，

9、食蟹猴皮層組織中DNMT1蛋白的表達(dá)逐漸下降。正常23歲齡組低于3～6歲齡組及12歲齡組(P<0.01)。此外，23PbE組DNMT1蛋白表達(dá)水平也低于23CT組。各組DNMT3a及MeCP2與DNMT1蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致(P<0.05)。
　　 2.發(fā)育早期鉛暴露對(duì)食蟹猴神經(jīng)生物相關(guān)基因表達(dá)的影響在篩檢的588個(gè)與神經(jīng)生物學(xué)相關(guān)基因中，發(fā)現(xiàn)16個(gè)基因的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，僅6個(gè)基因在鉛暴露組的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。其中20個(gè)基因的

10、啟動(dòng)子區(qū)域富含CpG。
　　 3.年齡及發(fā)育早期鉛暴露對(duì)食蟹猴組蛋白修飾水平的影響HDAC活性在正常23歲齡組食蟹猴皮層組織中的表達(dá)低于3～6歲齡組及12歲齡組(P<0.05)。與23CT組比較，23PbE組HDAC活性明顯升高(P<0.01)。而特異性位點(diǎn)H3K9ac、H4K12ac蛋白水平在正常23歲齡組食蟹猴皮層組織中的表達(dá)均明顯高于3～6歲齡組及12歲齡組(P<0.01)。23PbE組上述組蛋白位點(diǎn)乙酰化水平明顯低于23

11、CT組(P<0.01)。
　　 正常23歲齡組G9a蛋白的表達(dá)明顯高于3～6歲齡組及12歲齡組。23PbE組G9a蛋白表達(dá)水平高于23CT組(P<0.05)。各組特異性位點(diǎn)H3K9me2、H3K27me2蛋白表達(dá)水平與之一致。
　　 4.醋酸鉛對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞AβPP、NEP及Aβ1-40表達(dá)的影響不同濃度醋酸鉛暴露48 h后，SH-SY5Y細(xì)胞AβPP表達(dá)增加，并存在濃度依賴性。NEP蛋白在20μM～100μM醋酸

12、鉛暴露組(PbE)細(xì)胞中的表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.01)。10μM～100μM PbE組細(xì)胞AβPP mRNA的表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.01)。5μM及10μM PbE組細(xì)胞NEP mRNA的表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.01)。細(xì)胞經(jīng)低濃度鉛暴露(10μM)后，其NEP活性的下調(diào)發(fā)生于鉛暴露48 h(P<0.01)。與對(duì)照組比較，5μM及10μM PbE組細(xì)胞NEP的活性水平均降低(P<0.01)。
　　 隨著醋酸鉛濃度的升高，細(xì)

13、胞培養(yǎng)液中Aβ1-40的表達(dá)逐漸升高(P<0.01)。細(xì)胞培養(yǎng)液中Aβ1-40含量與AβPP mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，而與NEP蛋白及活性水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。
　　 5.醋酸鉛對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞組蛋白修飾的影響與對(duì)照組比較，50μM及100μM醋酸鉛暴露可抑制SH-SY5Y細(xì)胞H3K9ac、H4K12ac位點(diǎn)組蛋白的表達(dá)(P<0.01)。經(jīng)100μM鉛暴露48 h，整體HDAC的活性水平明顯升高

14、(P<0.01)。鉛暴露24 h時(shí)給予細(xì)胞10μM VPA干預(yù)，可顯著下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞的HDAC活性及Aβ1-40的表達(dá)(P<0.01)。
　　 與對(duì)照組比較，100μM PbE組H3K9me2位點(diǎn)甲基化表達(dá)明顯增加，同時(shí)50μM及100μM PbE組H3K27me2位點(diǎn)甲基化表達(dá)明顯增加(P<0.01)。與對(duì)照組比較，100μM PbE組G9a蛋白的表達(dá)明顯增加(P<0.01)，細(xì)胞內(nèi)G9a的定位表達(dá)結(jié)果與之一致。