永生化成人肝細(xì)胞的構(gòu)建及生物學(xué)特性初步研究.pdf

1、肝功能衰竭是各種嚴(yán)重肝病的終末期表現(xiàn)，是威脅人類健康的重要原因之一，雖然原位肝移植是目前治療肝細(xì)胞衰竭的最有效手段，但卻受到捐獻(xiàn)器官短缺和手術(shù)費(fèi)用較高的限制，而建立有效的人工肝治療，一方面可以為尋求合適的肝移植供體提供時(shí)間，另一方面可以為肝細(xì)胞再生爭(zhēng)取時(shí)間。目前各種物理型人工肝輔助治療系統(tǒng)雖然有不錯(cuò)的療效，但仍無(wú)法替代肝臟的各種復(fù)雜生物學(xué)功能。隨著細(xì)胞生物學(xué)和組織工程學(xué)的發(fā)展，體外生物人工肝支持系統(tǒng)(extracorporeal bio

2、artificial liver support system，EBLSS)在肝功能衰竭治療方面的應(yīng)用，正日益受到人們的關(guān)注。原代人肝細(xì)胞無(wú)疑是體外生物人工肝支持系統(tǒng)的治療最為理想的肝細(xì)胞來(lái)源，但原代人肝細(xì)胞，增殖傳代極為困難；動(dòng)物源性肝細(xì)胞雖可大量獲得，卻有著極大的風(fēng)險(xiǎn)，包括使病人出現(xiàn)人畜共患疾病(如使用豬肝細(xì)胞治療有潛在的感染豬內(nèi)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的可能)以及異種蛋白進(jìn)入病人體內(nèi)導(dǎo)致免疫反應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn)，因此合適的肝細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題仍是制約生物人工

3、肝發(fā)展的一個(gè)瓶頸問(wèn)題。目前，通過(guò)永生化的方法設(shè)計(jì)建立能無(wú)限增殖并具有良好生物代謝功能的人源性肝細(xì)胞系是解決肝細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題的主要研究方向之一。
　　 本課題通過(guò)將hTERT基因?qū)氤扇烁渭?xì)胞HL-7702，構(gòu)建了永生化成人肝細(xì)胞系(pLN/HL-7702)，并且對(duì)導(dǎo)入hTERT基因前后兩種細(xì)胞的形態(tài)、增殖狀況、生物學(xué)功能進(jìn)行了比較和研究，對(duì)新建永生化成人肝細(xì)胞系(pLN/HL-7702)致瘤性問(wèn)題進(jìn)行了初步研究，以期為進(jìn)一步研究解

4、決生物人工肝細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 研究將攜帶有hTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入成人肝細(xì)胞HL-7702，通過(guò)RT-PCR，western-blot，和IEA(間接免疫熒光法)在基因和蛋白水平對(duì)所建細(xì)胞系(pLN/HL-7702)進(jìn)行了鑒定；在倒置相差顯微鏡和透射電鏡下觀察并比較了基因?qū)肭昂蠹?xì)胞的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)；采用MTT染色法檢測(cè)在基因?qū)肭昂蟾渭?xì)胞的增殖能力變化，連續(xù)觀察并描繪生長(zhǎng)曲線；采用RT-PCR法檢測(cè)基

5、因?qū)肭昂蟾渭?xì)胞功能基因表達(dá)情況；采用western-blot檢測(cè)基因?qū)肭昂蟾渭?xì)胞細(xì)胞色素P450的表達(dá)；并通過(guò)軟瓊脂實(shí)驗(yàn)、裸鼠致瘤性實(shí)驗(yàn)對(duì)所建細(xì)胞系pLN/HL-7702的致瘤性進(jìn)行了初步分析。
　　 結(jié)果：1.RT-PCR、western-bolt和IEA可檢測(cè)到hTERT基因在肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，可檢測(cè)到相關(guān)蛋白；2.光鏡和電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)基因?qū)肭昂蟾渭?xì)胞的差異；3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞在導(dǎo)入基因后增殖

6、能力有了明顯的提高；4.肝細(xì)胞功能基因的轉(zhuǎn)錄在轉(zhuǎn)染前后均可檢測(cè)到；5.基因?qū)肭昂蠹?xì)胞上清的檢測(cè)表明肝細(xì)胞的一般生化功能未受影響；6.基因?qū)肭昂蟾渭?xì)胞通過(guò)western-bolt均可檢測(cè)到細(xì)胞色素P450的表達(dá)；7。軟瓊脂實(shí)驗(yàn)、裸鼠致瘤性實(shí)驗(yàn)未提示pLN/HL-7702有致瘤性表現(xiàn)。
　　 討論：本研究成功建立永生化成人肝細(xì)胞系pLN/HL-7702，其體外增殖能力較原細(xì)胞系HL-7702明顯提高，在形態(tài)、結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能方面