樹鼩肝細(xì)胞永生化方法的建立及ith6.1細(xì)胞系特性分析

1、博士學(xué)位論文學(xué)校代碼： 1 0 0 2 3學(xué) 號：B 2 0 1 3 0 1 8 0 0 4樹昀肝細(xì)胞永生化方法的建立及I T H 6 ．1 細(xì)胞系特性分析T h e E s t a b l i s h m e n t o f aT u p a i aH e p a t o c y t e I m m o r t a l i z a t i o nM e t h o d a n d C h a r a c t e r i z a t i

2、 o n o fT u p a i a I m m o r t a l i z e dC e l lL i n e I T H 6 ．1所 院 ：姓 名 ：指導(dǎo)教師：導(dǎo)師小組：學(xué)科專業(yè)：研究方向：完成日期：醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所馬娜董少忠研究員寸群副研究員免疫學(xué)樹晌細(xì)胞模型建立2 0 1 6 年5 月一．實驗材料????????????????????????????一3 61 ．病毒?????????????????????????????

3、?3 62 ．細(xì)胞系?????????????????????????????3 63 ．質(zhì)粒與載體???????????????????????????3 74 ．抗1 本????????????????????????????????????????3 75 ．試劑盒??????????????????????????????????????．．3 76 ．主要試劑????????????????????????????3 77 ．

4、實驗耗材????????????????????????????3 88 ．儀器設(shè)備????????????????????????????3 9二、實驗方法????????????????????????????3 91 ．?dāng)y目的基因的慢病毒載體的包裝??????????????????3 92 ．含S V 4 0 T A g 基因重組慢病毒感染樹駒原代肝細(xì)胞???????????．．3 93 ．I T H 6 細(xì)胞的傳代、凍存和復(fù)蘇

5、???????????????????4 04 ．有限稀釋法挑選單克隆細(xì)胞株???????????????????4 05 ．I T H 6 ．1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察??????????????????????．4 16 ．I T H 6 ．1 的P A S 染色鑒定???????????????????????4 17 ．I T H 6 ．1 油紅O 染色鑒定???????????????????????4 18 ．間接免疫熒光法( I

6、F A ) 檢鋇I J I T H 6 ．1 的S V 4 0 T A g 和A I b 表達(dá)????????4 19 ．W e s t e r nb l o t 檢測I T H 6 ．1 的S V 4 0 T A g 、A I b 表達(dá)?????????????．4 11 0 ．I T H 6 ．1 肝細(xì)胞細(xì)胞功能基因的R T - P C R 分析??????????????4 21 1 ．I T H 6 ．1 的生長曲線的繪制( 計

7、數(shù)法) ????????????????4 51 2 ．I T H 6 ．1 培養(yǎng)上清白蛋白、尿素氮、轉(zhuǎn)氨酶測定????????????4 51 3 ．I T H 6 ．1 種屬來源鑒定實驗?????????????????????4 51 4 ．P T H 6 和I T H 6 ．1 的S T R 分型?????????????????????4 51 5 ．I T H 6 ．1 染色體核型分析????????????????????

8、??4 71 6 ．實時定量P C R 方法測定不同代次I T H 6 ．1 的T ／s 值????????????4 81 7 ．I T H 6 ．1 的病毒易感性實驗?????????????????????4 91 ．P T H 6 經(jīng)慢病毒感染后的傳代、凍存后復(fù)蘇?????????????．．5 12 ．通過有限稀釋法篩選獲得I T H 6 的亞克隆細(xì)胞株：I T H 6 ．1 ????????．5 33 ．永生化樹踟肝細(xì)胞I

9、T H 6 ．1 的形態(tài)特征????????????????．5 44 ．永生化樹嗣肝細(xì)胞I T H 6 ．1 中可以檢測到S V 4 0 T A g 的表達(dá)?????????5 55 ．I T H 6 ．1 中檢測到肝細(xì)胞特異功能蛋白白蛋白的表達(dá)??????????．5 66 ．I T H 6 ．1 的P A S 染色鑒定???????????????????????5 87 ．I T H 6 ．1 的油紅0 染色鑒定????????

10、?????????????．．5 88 ．I T H 6 ．】r 細(xì)胞的R T - P C R 檢測?????????????????????．5 99 ．I T H 6 ．1 的細(xì)胞生長曲線( 計數(shù)法) ?????????????????．6 01 0 ．I T H 6 ．1 細(xì)胞培養(yǎng)上清液白蛋白、尿素氮、轉(zhuǎn)氨酶的測定????????6 01 1 ．I T H 6 ．1 細(xì)胞的種屬鑒定?????????????????????。6 1

11、1 2 ．P T H 6 與I T H 6 ．1 在中國樹鼬的8 個S T R 位點上的基因分型結(jié)果相同???．6 31 3 ．I T H 6 ．1 染色體分析????????????????????????6 41 4 ．I T H 6 ．1 端粒相對長度隨著細(xì)胞傳代次數(shù)增加逐漸縮短?????????6 51 5 ．I T H 6 ．1 的病毒易感性研究?????????????????????6 6四．討論?????????????