永生化豬肝細(xì)胞系的建立及其鑒定.pdf

1、各種原因所致的急慢性肝功能衰竭,因其病情危重,進展迅速,病死率高,是臨床亟待解決的治療性難題.自人工肝支持系統(tǒng)(artificial liver supportsystem,ALSS)被用于治療各種急性肝功能衰竭,已取得非常好的療效.但是,由于非生物型人工肝缺乏肝細(xì)胞的代謝、生物轉(zhuǎn)化等功能.然而生物型人工肝(bioartificial liver,BAL)依賴于生物反應(yīng)器中的肝細(xì)胞發(fā)揮著肝細(xì)胞的氨代謝和生物轉(zhuǎn)化等重要作用,可以彌補非生物

2、型人工肝的上述缺陷,因此,近年來,以肝細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物型人工肝是目前人工肝治療肝衰竭的研究熱點,不同類型的BAL不斷出現(xiàn),迄今4種BAL系統(tǒng)業(yè)已開始進行Ⅱ-Ⅲ期臨床驗證,譬如HepatAssist、ELAD等.初步結(jié)果證明這些BAL治療是安全、有效的,沒有明顯的不良事件出現(xiàn). 由于供肝的短缺,生物型人工肝的發(fā)展亦面臨著困難.然而,由于豬肝細(xì)胞的代謝功能與人肝細(xì)胞最為接近,目前大多數(shù)基礎(chǔ)和臨床研究均采用原代豬肝細(xì)胞作為肝細(xì)胞源.但是,由于

3、原代肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)時均存在生長條件要求嚴(yán)格、存活時間及產(chǎn)量有限、難以傳代等問題,這樣就限制了生物型人工肝的發(fā)展.采用永生化技術(shù)建立永生化肝細(xì)胞,是解決生物型人工肝細(xì)胞來源的重要途徑之一,可為生物型人工肝治療肝衰竭提供大量的肝細(xì)胞成為可能. 本實驗采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法將SV40大T抗原(SV40 LT)和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)導(dǎo)入到原代豬肝細(xì)胞,建立永生化豬肝細(xì)胞系.將為生物型人工肝系統(tǒng)體外評價、細(xì)胞移植、體外藥物代

4、謝模型等提供了理想的肝細(xì)胞源.材料與方法首先分子克隆技術(shù)分別構(gòu)建含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、SV40大T抗原重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體;用磷酸鈣沉淀法分別將hTERT/pLPCX和SV40 LT/pLXSN轉(zhuǎn)染至對數(shù)生長期的PT67細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素、G418藥物壓力篩選,建立兩株產(chǎn)毒細(xì)胞株,并測定兩種細(xì)胞上清的病毒滴度. 其次,用含SV40大T抗原的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒上清感染原代豬肝細(xì)胞,G418藥物進行壓力篩選獲得細(xì)胞克隆;接著,用含人端粒酶逆轉(zhuǎn)

5、錄酶的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒上清感染細(xì)胞克隆,經(jīng)嘌呤霉素篩選,建立永生化豬肝細(xì)胞. 最后,采用倒置顯微鏡、電鏡觀察細(xì)胞形態(tài);Western blot法檢測永生化豬肝細(xì)胞中端粒酶和SV40大T抗原的表達;RT-PCR檢測永生化豬肝細(xì)胞HepLP的ALB mRNA的表達;細(xì)胞增殖實驗繪制細(xì)胞生長曲線;生化儀檢測細(xì)胞上清的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)等指標(biāo); ELISA雙抗體夾心法檢測細(xì)胞上清的豬白蛋白;裸鼠致瘤性實驗觀察

6、其有無腫瘤形成、以及進行細(xì)胞染色體核型分析. 結(jié)果： 成功的構(gòu)建了hTERT/pLPCX和SV40 LT/pLXSN重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,獲得產(chǎn)生含hTERT、SV40 LT重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的兩種細(xì)胞株. 用含SV40大T抗原、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代豬肝細(xì)胞,并經(jīng)過篩選后獲得三個耐嘌呤霉素和G418藥物的永生化豬肝細(xì)胞克隆;并傳代60代以上.并對其中一個命名為HepLP的永生化豬肝細(xì)胞進行鑒定.該細(xì)

7、胞均為單層貼壁生長,肝細(xì)胞的形態(tài)呈橢圓形、典型的上皮細(xì)胞樣特征.在透射電子顯微鏡下,所獲得的豬肝細(xì)胞呈典型的肝細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu),細(xì)胞內(nèi)豐富的糖原顆粒和大量的線粒體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰可見; 在掃描電子顯微鏡下,永生化豬肝細(xì)胞的表面可見典型的微狀突起物.永生化豬肝細(xì)胞呈典型的"S"型生長.永生化豬肝細(xì)胞的染色體數(shù)目為38(2倍體). 用Western bllot檢測該細(xì)胞的蛋白,在120KD處出現(xiàn)一條陽性帶,表明該細(xì)胞系表達端粒酶;在

8、93KD處出現(xiàn)條帶,表明該細(xì)胞系也表達SV40大T抗原.以原代豬肝細(xì)胞為陽性對照,一步法RT-PCR擴增檢測結(jié)果顯示:第6代,第22代,47代的永生化豬肝細(xì)胞HepLP和原代豬肝細(xì)胞在270 bp處均出現(xiàn)DNA條帶,表明該永生化豬肝細(xì)胞具有表達ALB mRNA的等肝細(xì)胞基本生物學(xué)功能. 在永生化豬肝細(xì)胞的培養(yǎng)上清中均可檢測到谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、尿素氮(BUN)的分泌.采用ELISA雙

9、抗體夾心法可檢測到永生化豬肝細(xì)胞培養(yǎng)上清的特異性豬白蛋白的分泌.裸鼠致瘤性試驗顯示注射永生化豬肝細(xì)胞的裸鼠6個月后仍沒有觀察到腫瘤. 結(jié)論： 1.構(gòu)建了hTERT/pLPCX和SV40 LT/pLXSN重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體. 2. 建立了含hTERT基因、SV40 LT基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的兩種產(chǎn)毒細(xì)胞株. 3.創(chuàng)建了永生化豬肝細(xì)胞的制備方法,并申請發(fā)明專利.將為人源性肝細(xì)胞、肝非實質(zhì)細(xì)胞等其他細(xì)胞的永生化