轉(zhuǎn)染hTERT基因建立永生化成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文轉(zhuǎn)染hTERT基因建立永生化成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)研究姓名：呂標(biāo)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：口腔臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：陶謙20090518中山大學(xué)碩七學(xué)位論文轉(zhuǎn)染hTERT基因建立永生化成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)研究等生物學(xué)特點(diǎn)提供了有價(jià)值的體外模型。材料和方法1參照分子克隆技術(shù)構(gòu)建含有hTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSNneohTERT，用脂質(zhì)體法將pLXSNneo—hTERT轉(zhuǎn)染至PA317細(xì)胞，經(jīng)G418藥物壓力篩選，

2、建立產(chǎn)毒的PA317病毒包裝細(xì)胞系，測定病毒滴度。2收集手術(shù)切除的AM腫瘤組織，組織塊法進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞爬出后常規(guī)消化傳代，采用差速消化法去除腫瘤細(xì)胞中混雜的成纖維細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry，ICC)鑒定細(xì)胞的上皮來源。3收集病毒包裝PA317細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，感染AM細(xì)胞，G418篩選抗性克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)，建立永生化AM細(xì)胞株。4采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；ICC檢測廣譜細(xì)胞角蛋白(PANeyt

3、okeratin，pCK)、波形蛋白(Vimentin，Vim)表達(dá)；繪制細(xì)胞生長曲線；計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間(DoublingTime，DT)及群體倍增數(shù)(PopulationDoublings，PDL)，繪制細(xì)胞倍增曲線：細(xì)胞衰老口半乳糖苷酶(SenescenceAssociatedDGalactosidase，SA13Gal)染色檢測細(xì)胞衰老；端粒重復(fù)序列擴(kuò)增(Telomericrepeatamplification，TRAP)銀染

4、法檢測轉(zhuǎn)染前后AM細(xì)胞中端粒酶活性表達(dá)；兩步法逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscription—polymerasechainreaction，RTPCR)檢測轉(zhuǎn)染前后AM細(xì)胞中hTERT、p16、p21和p53基因的表達(dá)情況；Westemblot檢測轉(zhuǎn)染前后AM細(xì)胞中hTERT、p16、p21和p53蛋白的表達(dá)情況；以106個(gè)細(xì)胞接種裸鼠檢測腫瘤形成。結(jié)果I雙酶切鑒定及測序結(jié)果顯示pLXSNneohTERT重組逆轉(zhuǎn)錄病毒