牛傳染性鼻氣管炎抗體膠體金免疫層析方法的建立.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎是由牛傳染性鼻氣管炎病毒也稱牛皰疹病毒Ⅰ型引起牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，臨床癥狀有上呼吸道及氣管粘膜發(fā)炎，并伴有結(jié)膜炎、流產(chǎn)、乳腺炎等。更嚴重的危害是持續(xù)性感染，使得該病的診斷、預(yù)防及治療極為困難。該病的現(xiàn)場診斷中，現(xiàn)有的抗體檢測方法存在許多弊端，因此建立一種快速、簡便、準確的抗體檢測方法非常必要。
　　本研究根據(jù)GenBank中已公布的牛傳染性鼻氣管炎病毒的全基因序列，利用DNAstar對牛傳染性鼻氣管炎

2、病毒的主要抗原糖蛋白gB進行預(yù)測分析，選出3段抗原指數(shù)高的氨基酸序列對應(yīng)的基因片段gBa、 gBb和gBc，將3段基因序列融合后合成得到重組克隆載體PUCK-gBabc。將融合基因gBabc定向插入到原核表達載體pET-28a(+)中成功構(gòu)建了重組原核表達載體pET28a-gBabc，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細胞BL21(DE3)pLysS中，IPTG誘導(dǎo)表達。通過SDS-PAGE電泳鑒定發(fā)現(xiàn)，重組陽性菌誘導(dǎo)2h后融合蛋白表達量最

3、大，其分子大小約為44.3kDa(含3.5kDa的pET-28a(+)肽段）。經(jīng)Weatern blot鑒定證實融合蛋白具有良好的免疫學(xué)活性。
　　純化后的融合蛋白gBF經(jīng)透析復(fù)性作為檢測線上的包被抗原，劃線濃度為0.6mg/mL。質(zhì)控線上用提純的兔IgG作為捕獲蛋白，劃線濃度最終確定為1.5mg/mL。SPA用15NM的膠體金溶液標記，標記PH設(shè)為6.0，SPA標記濃度控制在0.1mg/mL，最后得到金標-SPA濃縮液，使用前用

4、復(fù)溶緩沖液5倍稀釋后涂覆在金標墊上。劃線好的NC膜及處理好金標墊和樣品墊放于37℃培養(yǎng)箱中烘干30min，切條后裝卡槽，制成用于檢測牛傳染性鼻氣管炎抗體的膠體金免疫層析試紙條。用牛傳染性鼻氣管炎標準陽性血清和陰性血清對本試驗制備的檢測試紙條進行有效性驗證，結(jié)果在檢測牛傳染性鼻氣管炎標準陽性血清時，出現(xiàn)兩條紅色反應(yīng)帶，呈陽性反應(yīng)，檢測陰性血清時只在質(zhì)控線處出現(xiàn)紅色反應(yīng)條帶，呈陰性反應(yīng)，表明驗證結(jié)果正確;交叉試驗結(jié)果證明制備的試紙條與牛副結(jié)