玻璃體腔注射鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療視網(wǎng)膜色素變性的臨床前研究.pdf

1、視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa,RP）是一類(lèi)以進(jìn)行性視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡為特征的致盲性疾病。臨床分為典型及非典型兩類(lèi)。在亞洲人中常見(jiàn)的RP類(lèi)型為典型RP和非典型RP中的結(jié)晶樣視網(wǎng)膜色素變性（Bietti’s crystalline dystrophy，BCD）2.尚無(wú)有效臨床治療方法。目前對(duì)RP治療的研究熱點(diǎn)包括基因治療，營(yíng)養(yǎng)因子補(bǔ)充、干細(xì)胞移植及視覺(jué)假體植入，其中外源性營(yíng)養(yǎng)因子攝入，相對(duì)簡(jiǎn)捷、安全且可以和其他治

2、療方法聯(lián)合應(yīng)用，是可行性較強(qiáng)并具有較好研究前景的治療方法。此外，臨床研究需要靠靈敏的檢測(cè)指標(biāo)來(lái)評(píng)估療效，但目前對(duì)BCD的研究多限于基因突變的篩選以及臨床表現(xiàn)的個(gè)案報(bào)道。缺乏對(duì)BCD疾病進(jìn)展程度，特別是視覺(jué)功能損害程度的客觀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。
　　神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中研究最為透徹的一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。研究表明NGF的減少或缺乏與RP疾病的發(fā)生發(fā)展存在重要的關(guān)系3-5。眼局部補(bǔ)充外源性NGF能夠明顯延緩視網(wǎng)膜色素變

3、性動(dòng)物模型中感光細(xì)胞的變性5。
　　從小鼠頜下腺提取的NGF的肌肉注射劑型作為國(guó)家準(zhǔn)字號(hào)藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用為NGF治療視網(wǎng)膜變性疾病帶來(lái)了契機(jī)。但由于全身給藥非目標(biāo)性及達(dá)眼部藥物濃度的有限性，使其應(yīng)用受到一定限制。以往對(duì)研究者多采用球周注射N(xiāo)GF來(lái)研究其對(duì)RP的治療作用，需要較高的藥物濃度及頻繁的重復(fù)注射。玻璃體腔注射技術(shù)具有眼內(nèi)直接給藥的優(yōu)勢(shì)，但玻璃體腔注射N(xiāo)GF在眼內(nèi)各組織特別是視網(wǎng)膜的藥物分布情況尚未見(jiàn)報(bào)道。研究證明玻璃體腔注

4、射N(xiāo)GF能夠延緩缺血、視網(wǎng)膜脫離等導(dǎo)致的繼發(fā)性視網(wǎng)膜變性6,7，但并沒(méi)有報(bào)道玻璃體腔注射N(xiāo)GF對(duì)所研究動(dòng)物模型的眼部安全性。而且尚無(wú)玻璃體腔注射N(xiāo)GF治療RP的基礎(chǔ)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期工作證實(shí)了20ug/0.1mlNGF進(jìn)行玻璃體腔注射對(duì)家兔及晚期典型RP患者的安全性，但單次注射N(xiāo)GF對(duì)晚期RP患者并沒(méi)有明顯的有效性。其原因可能是藥物含量低，注射頻率少，納入晚期RP病人視網(wǎng)膜損害嚴(yán)重。因此本研究需要進(jìn)一步增加NGF藥物劑量，探索重復(fù)注

5、射N(xiāo)GF策略，擴(kuò)大納入RP受試者的分期及分類(lèi)范圍，來(lái)深入進(jìn)行玻璃體腔注射N(xiāo)GF的臨床前研究。
　　臨床研究需要依靠靈敏的檢測(cè)指標(biāo)來(lái)進(jìn)行療效的評(píng)估，但目前對(duì)BCD的研究多限于基因突變的篩選以及臨床表現(xiàn)的個(gè)案報(bào)道。缺乏對(duì)BCD疾病進(jìn)展程度，特別是視覺(jué)功能損害程度的客觀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。因此明確臨床視覺(jué)功能檢查手段如視力、視野、電生理檢查等對(duì)各臨床分期BCD視網(wǎng)膜功能評(píng)價(jià)的作用是進(jìn)行治療學(xué)研究的前提。瞳孔光反射（PLR)是一種對(duì)視覺(jué)反應(yīng)的重要客

6、觀檢查手段8,9。劉勇博士前期研究中證實(shí)特定光刺激下瞳孔收縮強(qiáng)度能夠客觀、靈敏反應(yīng)典型RP感光細(xì)胞功能。但瞳孔收縮強(qiáng)度能否客觀量化評(píng)估包括晚期在內(nèi)的BCD病人感光細(xì)胞功能，尚未見(jiàn)系統(tǒng)研究。
　　因此本研究擬應(yīng)用較高劑量NGF，通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)明確玻璃體腔注射N(xiāo)GF后眼內(nèi)藥物含量分布、藥物對(duì)眼部安全性及對(duì)RCS大鼠有效性，進(jìn)而評(píng)估單次和重復(fù)玻璃體腔注射N(xiāo)GF治療典型RP及BCD受試者的安全性，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行玻璃體腔注射N(xiāo)GF對(duì)RP受試者

7、有效性的研究，為RP的治療探索新的藥物及使用方法。
　　本試驗(yàn)方案獲第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)通過(guò)（審批號(hào)：KY2008001），并在世界衛(wèi)生組織臨床試驗(yàn)注冊(cè)分部中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心成功注冊(cè)，（注冊(cè)號(hào)：ChiCTR-TRC-00000411）。試驗(yàn)內(nèi)容和研究結(jié)果如下：
　　1、動(dòng)物研究部分：
　　1）采用同位素示蹤法對(duì)比研究家兔玻璃體腔注射和球周注射125I-NGF眼部各組織藥物分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)玻璃體腔注射N(xiāo)

8、GF較球周注射能夠在眼內(nèi)各組織達(dá)到高的藥物濃度。玻璃體腔注射125I-NGF后，眼部各組織125I-NGF含量分布為玻璃體（471.75±4.42）＞視網(wǎng)膜（118.32±18.74）＞脈絡(luò)膜（79.13±8.82）＞虹膜睫狀體（68.29±14.41）＞房水（51.42±7.28）＞鞏膜（36.64±4.16）＞角膜（21.00±3.10）。
　　2）進(jìn)行兔眼玻璃體腔注射N(xiāo)GF的眼部安全性評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)觀察其角膜、晶體

9、、玻璃體、視網(wǎng)膜均未見(jiàn)明顯異常，1m時(shí)行組織病理檢查視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常。
　　3）采用DAPI染色視網(wǎng)膜外核層厚度測(cè)量以及TUNEL試驗(yàn)檢測(cè)視網(wǎng)膜外核層感光細(xì)胞凋亡指數(shù)的方法評(píng)估P30d RCS大鼠重復(fù)玻璃體腔注射N(xiāo)GF的有效性。結(jié)果顯示在P45d，P60d，P90d時(shí)，重復(fù)玻璃體腔注射N(xiāo)GF組其視網(wǎng)膜外核層厚度厚于生理鹽水注射組及空白對(duì)照組（P＜0.05）；NGF治療組視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡指數(shù)低于生理鹽水注射組及空白對(duì)照組（P

10、＜0.05）。
　　2、進(jìn)行了單次玻璃體腔注射N(xiāo)GF對(duì)20例典型RP及15例BCD安全性的臨床前試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)NGF治療后1d、7d、1m時(shí)BCD主觀感覺(jué)好于典型RP。典型RP治療后眼部炎癥反應(yīng)明顯，1d時(shí)評(píng)分大于3分占30％，7d時(shí)占10％，1m炎癥消失；BCD治療后眼部炎癥反應(yīng)輕，1d時(shí)評(píng)分大于3分占10％，7d時(shí)炎癥已經(jīng)消失。長(zhǎng)期觀察（12m）典型RP及BCD眼部B超、眼底及OCT未見(jiàn)明顯異常。不良反應(yīng)發(fā)生率：典型RP為20％，

11、BCD為0.基于此結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行了重復(fù)玻璃體腔注射N(xiāo)GF對(duì)BCD安全性的臨床前試驗(yàn)，對(duì)每3月重復(fù)注射N(xiāo)GF及每1月重復(fù)注射N(xiāo)GF的安全性進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)兩組BCD受試者均主觀感覺(jué)良好，眼部炎癥反應(yīng)輕，無(wú)炎癥疊加現(xiàn)象，長(zhǎng)期觀察兩組BCD OCT均未見(jiàn)明顯異常。
　　3、通過(guò)眼底分期及視覺(jué)功能檢測(cè)對(duì)15例BCD受試者病情進(jìn)展程度進(jìn)行治療前評(píng)估，同時(shí)篩選對(duì)BCD有效的視覺(jué)功能檢測(cè)指標(biāo)。1例早期BCD85°視野檢查為1級(jí)、fERG五項(xiàng)檢查為

12、B級(jí)，mERG已顯示出明顯異常。8例中期BCD fERG、85°視野檢查存在多個(gè)分級(jí)階段的異常程度。mERG為熄滅型。6例晚期BCD85°視野尚可定位殘存視敏度較弱的視島，但fERG、mERG均為熄滅型。采用自主研制的全視野光刺激瞳孔記錄儀對(duì)BCD受試者進(jìn)行PLR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BCD受試者瞳孔收縮強(qiáng)度均普遍低于正常人，且隨BCD分期進(jìn)展，瞳孔收縮強(qiáng)度降低。低亮度藍(lán)光刺激下，瞳孔收縮強(qiáng)度隨病情分期變化明顯，中等亮度白光刺激下瞳孔收縮強(qiáng)度與fE

13、RG max-b波振幅呈正相關(guān)。提示暗適應(yīng)全視野刺激下的瞳孔收縮強(qiáng)度可以作為BCD患者感光細(xì)胞功能的客觀量化指標(biāo)。
　　4．對(duì)15例BCD受試者進(jìn)行了每1月及每3月重復(fù)玻璃體腔注射N(xiāo)GF療效對(duì)比的臨床前試驗(yàn)。結(jié)果表明：經(jīng)玻璃體腔注射后1月受試者視力，視野，藍(lán)光、白光刺激下瞳孔收縮強(qiáng)度均有所提高。經(jīng)重復(fù)玻璃體腔注射N(xiāo)GF后，每1月重復(fù)治療組視力，視野，藍(lán)光、白光刺激下瞳孔收縮強(qiáng)度均能夠維持首次治療后的視覺(jué)改善狀態(tài)，而每3月重復(fù)治療組

14、則有所波動(dòng)，在每次治療后3月時(shí)有回復(fù)的趨勢(shì)。停藥后兩組視功能均有回退的傾向。
　　綜上所述，本研究得到如下結(jié)論：
　　1、玻璃體腔注射N(xiāo)GF在兔眼各組織內(nèi)特別是視網(wǎng)膜組織可達(dá)到高藥物含量，這一治療方法對(duì)兔眼是安全的，證明了玻璃體腔注射N(xiāo)GF是一種理想的治療眼底疾病方法。
　　2、重復(fù)玻璃體腔注射N(xiāo)GF能延緩RCS大鼠ONL層變性，為NGF治療RP的臨床研究提供了重要的基礎(chǔ)試驗(yàn)依據(jù)。
　　3、通過(guò)臨床研究證實(shí)了玻璃