誘導非人靈長類動物預致敏同種腎臟移植“適應”的研究.pdf

1、因輸血、妊娠、多次移植等原因成為預致敏的高危受體病人，在接受同種異體器官移植后易發(fā)生較嚴重的體液性排斥反應，如超急性、加速性或急性血管性排斥反應。
　　 且隨著器官移植開展歷史的延長，等待接受二次、甚至三次移植的預致敏患者將越來越多。目前臨床針對這些預致敏患者的“脫敏”治療，價格昂貴、副作用大、效果不穩(wěn)定且僅適用于部分病人。我們擬建立非人靈長類動物皮膚預致敏后腎臟移植的動物研究模型，嘗試應用“適應”策略誘導移植腎的長期存活，并闡

2、述其相關機制。
　　 準確的鑒定非人靈長類的血型是非人靈長類動物器官移植研究的基礎。非人靈長類的ABO 血型抗原都表達在組織器官內(nèi)，而不是在紅細胞上，這給非人靈長類血型的鑒定帶來很大的困難。為找到更加簡捷、準確鑒定非人靈長類動物類人ABO 血型的方法，采用近年來臨床上廣泛應用的卡式微柱凝膠正、反定型法對38只獼猴和26只食蟹猴的血型進行了鑒定，并與腎組織免疫組化法的檢測結果進行比較。
　　 結果顯示：卡式微柱凝膠正定型法

3、的檢測結果中無一例為陽性結果；血漿中的纖維蛋白原和人-猴種屬間非特異性抗體都會對卡式微柱凝膠反定型法的部分檢測結果產(chǎn)生干擾；采用經(jīng)正常人O型紅細胞吸附處理后的清亮血清，卡式微柱凝膠反定型法的檢測結果明確，與免疫組化法判定結果一致。由此得出：采用經(jīng)人正常O型紅細胞吸附處理后的清亮血清作為樣本，卡式微柱凝膠反定型法可以準確的判定獼猴或食蟹猴的血型，是個更為簡單、快捷的方法，推薦為非人靈長類血型檢測的常規(guī)方法。
　　 建立非人靈長類預

4、致敏后腎臟移植加速性排斥反應模型。取血型相容的正常獼猴配對，預先將供體腹部全層皮膚移植到受體背部，使受體預致敏。2 周后再將同一供體的左側腎臟移植到受體腹腔內(nèi)，同時切除受體猴自體雙腎。以未致敏的猴腎移植作為對照，觀察術后受體猴血肌酐水平變化，移植物存活時間及病理特點；觀察臨床常用的CsA 為基礎的三聯(lián)免疫抑制治療（CsA+MMF+強的松）是否可以延長該模型移植物存活時間。結果顯示：4例未致敏腎移植猴（對照組，第1組）的存活時間分別為9、

5、18、8和7天；3例致敏后腎移植猴（致敏后未用藥組，第2組）的存活時間分別為3、3和4天；3例致敏后腎移植猴行CsA 三聯(lián)免疫抑制治療（致敏后用藥組，第3組），存活時間分別為2、3和4天。我們得出結論：①受體猴被供體皮膚預致敏后再行腎臟移植，可以加速移植物的排斥反應，是首個更加接近于人類預致敏后排斥反應特點的大動物研究模型。②該模型模擬的預致敏后加速性排斥反應不能被CsA 三聯(lián)免疫抑制治療方案逆轉。
　　 觀察非人靈長類動物預致

6、敏后腎臟移植加速性排斥反應的免疫學及病理學變化。采用非人靈長類動物皮膚預致敏后腎臟移植加速性排斥反應模型，檢測皮膚移植預致敏前后及腎移植后受體猴血清內(nèi)供體特異性抗體的變化，并在發(fā)生排斥反應時對移植腎進行免疫組化（測定補體、抗體的沉積和各類型淋巴細胞浸潤情況）及病理學分析。
　　 結果顯示：3例致敏未用藥受體猴均發(fā)生了加速性排斥反應。2例受體猴在預致敏后血清中供體特異性抗體明顯增加，對供體的淋巴毒反應明顯升高；腎移植后受者血清中供

7、體特異性抗體及針對供體的淋巴毒進一步升高。HE 染色顯示被排斥的移植腎內(nèi)明顯的動脈壞死、血栓形成、間質(zhì)出血、中性粒細胞浸潤；免疫組化及熒光染色顯示移植腎內(nèi)有大量的補體、抗體沉積（主要為IgG），而少見各類型的淋巴細胞浸潤。1例受體猴體內(nèi)的供體特異性抗體及對供體淋巴毒反應的升高程度不如前2例明顯，病理學變化以腎小管損傷為主。與致敏不用藥組相比，用藥組的3例受體猴移植腎被排斥的病理學變化較輕，沒有典型的動脈壞死、血栓形成或中性粒細胞大量浸潤

8、的情況，但仍有一定量的抗體和補體沉積，同時伴有一定量的淋巴細胞浸潤。
　　 我們得出結論：
　　 綜合本部分的研究，我們得出以下結論：①非人靈長類動物預致敏后腎臟移植加速性排斥反應的免疫學機制為：皮膚移植預致敏可以誘導受體猴產(chǎn)生程度不等的預存抗體，導致大部分移植腎在術后早期發(fā)生主要由抗體和補體介導的嚴重的急性體液性排斥反應。②其病理學特點為：以大量出血、壞死、血栓形成、中性粒細胞浸潤為主；
　　 有大量抗體和補體

9、片段沉積；較少的淋巴細胞浸潤為特點。③CsA 三聯(lián)免疫抑制治療方案雖然不能延長預致敏非人靈長類動物的移植腎存活時間，但可以明顯減輕移植腎的病理學變化，提示繼續(xù)改進和加強免疫抑制治療方案仍有可行性。
　　 針對預存抗體導致的體液性排斥反應，在非人靈長類動物預致敏后同種異體腎移植模型中研究短期補體抑制誘導“適應”的可行性及相關機制，以期為臨床預致敏高危移植探索出一種簡便易行的新方法。以獼猴為實驗動物，先行供體皮膚移植致敏 14天后再

10、行腎移植術，建立預致敏同種異體腎移植模型。在CsA 三聯(lián)治療的基礎上加用國產(chǎn)高純度眼鏡蛇毒因子（CVF）短期抑制補體活性（第4組）（n=5）。觀察移植腎存活時間，檢測抗供體特異性抗體及淋巴毒的變化，定期穿刺活檢標本或按計劃切取的移植腎標本行HE 染色以及一系列免疫組化檢測。結果顯示，在移植后2 周內(nèi)加用CVF 治療幾乎可以完全清除受者循環(huán)中的補體C3，移植腎存活時間顯著延長(41，140,>250，>500，>700天)，與前3組比較有

11、顯著性差異（P<0.05）。免疫學及病理學研究顯示，加用CVF 治療的第4組在移植腎活檢組織中僅有一定的抗體沉積，補體成分的沉積極少，雖然停用CVF后受者血清補體C3 水平和CH50 均恢復到正常水平，但移植腎仍能長期存活，另外可見保護性基因Bcl-2和補體調(diào)節(jié)蛋白CD46、CD59的表達明顯上調(diào)。我們得出結論：在CsA 三聯(lián)免疫抑制維持治療基礎上，短期抑制受者補體活性顯著延長預致敏后腎移植存活，大部分動物的移植腎在補體水平恢復正常后仍

12、能存活良好，成功誘導出“適應”，其機制可能與移植物內(nèi)保護性基因Bcl-2和補體調(diào)節(jié)蛋白的明顯上調(diào)表達有關。為解決臨床預致敏高危移植的難題提供了極具參考價值的實驗依據(jù)。
　　 在以往的研究基礎上，我們發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒因子（CVF）在器官移植領域有良好的應用前景。為此，我們對其理化性質(zhì)和免疫原性進行深入研究。采用的云南孟加拉種眼鏡蛇蛇毒因子（Y-CVF）較文獻報道的其它各種CVF 具有更高的活性和較少的用藥量。為探討Y-CVF 靜脈使用

13、是否誘導非人靈長類動物體內(nèi)產(chǎn)生特異性中和抗體和異種天然抗體，本研究給2只正常食蟹猴每2 周靜脈注射一次治療劑量的Y-CVF（0.05mg/kg），共4 次，檢測不同時間點血清內(nèi)補體C3 水平、總補體活性（CH50）、抗Y-CVF 抗體和抗豬內(nèi)皮細胞異種抗體的變化。結果顯示，前2 次注射Y-CVF 均有良好的清除補體效果，第3 次注射Y-CVF時補體僅被部分滅活，第4 次注射Y-CVF則基本無效。Western Blot和ELISA 均證

14、實特異性抗Y-CVF 抗體產(chǎn)生，且其滴度隨著Y-CVF 注射次數(shù)增加而遞增。多次注射Y-CVF后，并沒有在血清內(nèi)檢測到明顯的抗豬內(nèi)皮細胞抗體的變化。同時，在本研究中，我們還觀察了2例前期研究中長期存活的獼猴。在這2例獼猴的用藥方案中，Y-CVF和CsA+MMF+Pred 聯(lián)合使用，且僅在術后早期2 周內(nèi)多次小劑量使用。我們在獼猴體內(nèi)的補體水平恢復正常后，對血清內(nèi)的抗Y-CVF 抗體進行了檢測，發(fā)現(xiàn)并沒有很高滴度的中和抗體存在。在整個Y-

15、CVF治療過程中，補體C3 水平一直維持在極低水平，也沒有Y-CVF 注射無效的現(xiàn)象。我們因此得出結論：①Y-CVF 是一種具有更高抑制補體活性的蛇毒因子。②Y-CVF 具有一定的免疫原性。單獨使用能誘導非人靈長類動物產(chǎn)生中和抗體，從而導致Y-CVF失效。③Y-CVF 未誘導抗豬抗體（含抗α-Gal 抗體）的水平升高。④在聯(lián)合使用免疫抑制劑的基礎上，短期多次小劑量使用Y-CVF，可以明顯降低中和抗體的產(chǎn)生，具有良好的臨床應用前景。

16、>　　 總之，我們首先創(chuàng)建了簡單的、準確的鑒定非人靈長類動物血型的新方法，成功的建立了非人靈長類動物的預致敏腎臟移植加速性排斥反應模型。并在此基礎上，首次在非人靈長類預致敏后成功獲得同種腎臟移植的長期存活，并誘導出“適應”現(xiàn)象。
　　 我們也對該“適應”現(xiàn)象的機制進行了一定的探討，發(fā)現(xiàn)其機制可能與保護基因BcL-2的高表達有關。另外，我們也首次在大動物“適應”現(xiàn)象中，觀察到補體調(diào)節(jié)蛋白CD46和CD59的高表達現(xiàn)象，這可能是“