靈長(zhǎng)類動(dòng)物ABO血型不合腎移植超急性排斥反應(yīng)研究模型的建立.pdf

1、建立一種以流式細(xì)胞術(shù)（FCM）為基礎(chǔ)來(lái)檢測(cè)人ABO天然血型特異性抗體的新技術(shù)。使用商品來(lái)源的標(biāo)準(zhǔn)化人源紅細(xì)胞作為統(tǒng)一反應(yīng)的靶細(xì)胞，與相對(duì)應(yīng)的健康人血清樣本作用后再加入特異性熒光標(biāo)記的二抗，采用FCM檢測(cè)特異性血型抗體滴度水平。通過(guò)檢測(cè)所收集的52例健康人血清樣本并對(duì)比以傳統(tǒng)血液凝集法改進(jìn)的酶標(biāo)儀法，綜合比較分析兩種方法的檢測(cè)結(jié)果顯示：血型抗體（IgM為主）水平的變化趨勢(shì)上兩種方法關(guān)聯(lián)性較好，但FCM新方法顯示出更好的特異性、靈敏性和重復(fù)

2、性，并能夠半定量抗體及其分型（IgM、IgG及亞型）。FCM法是一種更為精確的天然血型抗體檢測(cè)技術(shù)，將來(lái)很可能逐步替代傳統(tǒng)的血液凝集法應(yīng)用于ABO血型不合移植的血型抗體定量化及用于手術(shù)監(jiān)測(cè)的全過(guò)程。
　　絕大部分靈長(zhǎng)類動(dòng)物存在與人類相似的ABO血型系統(tǒng)，本部分的研究采用改良FCM法檢測(cè)獼猴及食蟹猴血清中血型抗體水平及抗體的分布情況。同上一部分所述相同，以流式細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ)，預(yù)先用人O型濃縮紅細(xì)胞吸附猴血清中所含種屬間非特異性抗體采用

3、商品化來(lái)源的人源紅細(xì)胞作為靶細(xì)胞統(tǒng)一抗原的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)量，并通過(guò)加入特異性熒光標(biāo)記的抗人IgM或IgG二抗，對(duì)收集的實(shí)驗(yàn)用獼猴及食蟹猴的血清樣本預(yù)先用人O型濃縮紅細(xì)胞吸附猴血清中所含種屬間非特異性抗體，然后再進(jìn)行檢測(cè)，以健康受試者的血清樣本為對(duì)照，比較二者血型抗體水平的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)預(yù)先處理吸附猴血清中所含種屬間非特異性抗體的改良步驟后，F(xiàn)CM法同樣能夠準(zhǔn)確檢測(cè)猴的血型抗體水平及分型。結(jié)果顯示猴血清中天然血型抗體以IgM為主，滴度

4、水平明顯低于健康人
　?。≒＜0.05）。由此我們得出改良后的FCM法同樣適用于靈長(zhǎng)類動(dòng)物血清中血型抗體水平的檢測(cè)，這為構(gòu)建靈長(zhǎng)類動(dòng)物模擬人ABO血型不合器官移植模型的成功建立提供了關(guān)鍵技術(shù)保障。
　　本部分采用鑰孔戚血藍(lán)蛋白耦聯(lián)ABO血型抗原A特異表位（N－乙酰氨基半乳糖）（KLH-A）體內(nèi)預(yù)致敏的方法，成功提高了食蟹猴（B血型）循環(huán)內(nèi)的抗A血型抗體的水平。使用前述改良FCM法檢測(cè)猴致敏前后血型抗體IgM和IgG水平的變化

5、，并對(duì)比其差異。結(jié)果顯示通過(guò)KLH-A成功致敏后顯著升高食蟹猴血型抗體IgM水平，同時(shí)非血型預(yù)存抗體IgG的表達(dá)也有升高（P＜0.001），致敏效果及升高后抗體水平的維持時(shí)間都存在一定的個(gè)體化差異。由此可得出通過(guò)KLH-A或B的預(yù)致敏不但能夠特異刺激猴循環(huán)中針對(duì)血型抗原的抗體IgM的高表達(dá)，也提高了非特異抗體IgG的水平。通過(guò)預(yù)致敏后成功的升高了靈長(zhǎng)類大動(dòng)物的血型抗體水平，這也為模擬臨床ABO血型不合腎移植模型的成功建立提供了良好的實(shí)驗(yàn)

6、前提。
　　該部分我們成功建立了預(yù)致敏后施行同種異體ABO血型不合的腎移植術(shù)，并由血型抗體介導(dǎo)激活補(bǔ)體殺傷最終導(dǎo)致的超急性排斥反應(yīng)的模型。應(yīng)用改良FCM法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)食蟹猴體內(nèi)手術(shù)前預(yù)存天然ABO血型抗體滴度，結(jié)果顯示血型抗體水平較低的對(duì)照猴，直接施行ABO血型不合的同種異體腎移植無(wú)法導(dǎo)致超急性排斥反應(yīng)的免疫結(jié)果。病理研究顯示對(duì)照組移植腎臟并未顯示超急性排斥反應(yīng)的證據(jù)，而是顯示急性體液性和細(xì)胞性排斥混合的病理特征，免疫組化也未見(jiàn)血型抗

7、體（IgM或IgG）及補(bǔ)體片段（C4d及C5b-9）的沉積。而在KLH-A預(yù)致敏的實(shí)驗(yàn)組（n=2），受體猴（血型B）接受KLH-A預(yù)致敏14天后，再接受來(lái)自供體猴（血型A）的腎臟移植，結(jié)果2只受體猴的移植腎均在血管吻合開(kāi)放血流后1小時(shí)內(nèi)由鮮紅色變?yōu)楹谧仙?，其中一例?7cy05）于開(kāi)放血流一小時(shí)內(nèi)切取移植腎標(biāo)本，另一例（09cy15）于術(shù)后第二日切取移植腎標(biāo)本，病理和免疫組化的結(jié)果均顯示明確的超急性排斥的。我們對(duì)實(shí)驗(yàn)組受體猴施行腎移植術(shù)