宿主蛋白CBF-β調(diào)控靈長類動(dòng)物慢病毒Vif蛋白功能的生化機(jī)制研究.pdf

1、慢病毒能引起人或多種動(dòng)物長期性、進(jìn)展性免疫缺陷綜合征(AIDS)。常見慢病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)、梅迪維斯納病毒(MVV)以及唯一不編碼病毒感染性因子(Vif)的馬傳染性貧血病毒(EIAV)。除了EIAV驢白細(xì)胞弱毒疫苗具有廣譜、高效的保護(hù)作用，F(xiàn)IV滅活疫苗對(duì)部分FIV毒株具有保護(hù)，目前其余慢病毒均沒有安全、有效的疫苗

2、。因此，抗病毒治療成為對(duì)抗慢病毒，特別是HIV引起的艾滋病的有效方式。目前能有效抑制HIV-1復(fù)制的藥物主要是病毒酶類抑制劑，它們通過結(jié)合和抑制病毒生命周期中的多種酶類，來治療艾滋病。但是由于毒株的進(jìn)化和突變，耐藥性毒株逐漸出現(xiàn)，提示我們找到新的抗病毒靶點(diǎn)尤為急迫。
　　在HIV-1的多類靶細(xì)胞中表達(dá)天然免疫限制因子APOBEC3蛋白家族成員。APOBEC3通過誘導(dǎo)病毒基因組產(chǎn)生致死性突變來抑制包括HIV-1在內(nèi)的慢病毒復(fù)制。慢病

3、毒的Vif蛋白通過誘導(dǎo)APOBEC3的降解協(xié)助病毒清除細(xì)胞內(nèi)不利環(huán)境。近年的研究表明，HIV-1 Vif在誘導(dǎo)APOBEC3降解的時(shí)候需要細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄輔因子CBF-β的協(xié)助。干擾CBF-β的表達(dá)抑制了HIV-1 Vif的功能，進(jìn)而促進(jìn)了APOBEC3對(duì)HIV-1的抑制。因此，打斷CBF-β與HIV-1 Vif的相互作用成為新的治療艾滋病的靶點(diǎn)。而精細(xì)剖析CBF-β對(duì)HIV-1 Vif作用的生化機(jī)制有助于抗病毒藥物的設(shè)計(jì)和合成。
　

4、　本研究首先建立了穩(wěn)定干擾CBF-β表達(dá)的293T細(xì)胞系，從常見動(dòng)物慢病毒Vif蛋白著手，分析Vif誘導(dǎo)APOBEC3蛋白降解時(shí)是否需要CBF-β的輔助。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有靈長類動(dòng)物慢病毒Vif蛋白發(fā)揮功能時(shí)需要CBF-β的輔助，而非靈長類動(dòng)物慢病毒Vif蛋白不需要CBF-β的輔助即能誘導(dǎo)相應(yīng)物種APOBEC3降解。隨后對(duì)CBF-β調(diào)控靈長類動(dòng)物慢病毒Vif蛋白的生化特性進(jìn)行了多方面的分析。以非靈長類動(dòng)物慢病毒Vif蛋白為對(duì)比工具，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)

5、CBF-β改變了靈長類動(dòng)物慢病毒Vif蛋白在細(xì)胞內(nèi)的多重生化特性。結(jié)合蔗糖密度梯度離心實(shí)驗(yàn)，CHX細(xì)胞內(nèi)蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，CBF-β過表達(dá)增強(qiáng)了靈長類動(dòng)物慢病毒Vif蛋白在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性、延長其半衰期、減少其細(xì)胞內(nèi)寡聚化程度、改變其細(xì)胞內(nèi)分布模式等。
　　雖然初步的研究發(fā)現(xiàn)CBF-β特異性調(diào)控靈長類動(dòng)物慢病毒Vif蛋白的多重生化特性，但是對(duì)哪些生化特性的影響決定CBF-β對(duì)靈長類動(dòng)物慢病毒Vif蛋白功能的調(diào)

6、控并不清楚，因此，結(jié)合已有的報(bào)導(dǎo)，在本研究中選取了一些對(duì)Vif或者CBF-β功能重要的氨基酸，進(jìn)行了相應(yīng)氨基酸的突變實(shí)驗(yàn)，再來分析CBF-β過表達(dá)對(duì)靈長類動(dòng)物慢病毒Vif蛋白生化特性的改變。通過分析Vif或者CBF-β的功能缺失體，發(fā)現(xiàn)CBF-β與靈長類動(dòng)物慢病毒Vif蛋白進(jìn)行相互作用，改變其細(xì)胞內(nèi)分布模式，影響其細(xì)胞內(nèi)寡聚化程度只是CBF-β調(diào)控靈長類動(dòng)物慢病毒Vif蛋白功能的前提條件。CBF-β通過結(jié)合功能域與Vif結(jié)合后，再通過包

7、含第68位氨基酸在內(nèi)的調(diào)節(jié)功能域?qū)if進(jìn)行構(gòu)象改變、增強(qiáng)其細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性與CBF-β增強(qiáng)靈長類動(dòng)物慢病毒Vif蛋白功能密切相關(guān)。因此我們首次提出CBF-β通過“結(jié)合-調(diào)控”這樣的兩步作用機(jī)制輔助Vif功能的觀點(diǎn)。接下來，本研究探索了CBF-β促進(jìn)HIV-1 Vif蛋白穩(wěn)定性的分子機(jī)理。本研究發(fā)現(xiàn)CBF-β通過結(jié)合HIV-1 Vif蛋白，抑制了其多個(gè)賴氨酸位點(diǎn)的聚泛素化修飾，進(jìn)而減少其在細(xì)胞內(nèi)通過蛋白酶體途徑的降解，增強(qiáng)Vif蛋白在細(xì)胞內(nèi)