玉米ae-wx和sh1突變體胚乳基因表達(dá)譜的變化和淀粉生物合成的研究.pdf

1、玉米(Zea mays L.ssp.Mays)是食品和飼料的主要來(lái)源之一,其淀粉產(chǎn)量和品質(zhì)決定了它在人類(lèi)生產(chǎn)和生活中的地位。為深入了解玉米淀粉合成的分子調(diào)控機(jī)理,本研究首先以B73、ae/wx和sh1授粉后15天的胚乳為材料,利用18K Affymetrix玉米基因組芯片平臺(tái),研究了突變體材料中基因表達(dá)譜的變化,發(fā)現(xiàn)了淀粉合成受阻后糖的積累對(duì)其它物質(zhì)代謝和基因表達(dá)調(diào)控的影響；在此基礎(chǔ)上,對(duì)可能參與淀粉合成的基因以多個(gè)自交系為材料,分析它

2、們?cè)谌~片和胚乳發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式,研究了不同成員對(duì)胚乳淀粉合成的貢獻(xiàn)。同時(shí),為滿足工業(yè)上對(duì)高直鏈淀粉的需求,利用RNAi策略敲除ZmSBE IIb或ZmSBE I & ZmSBE IIb。主要結(jié)果如下： 1.胚乳基因表達(dá)譜分析 以B73、sh1、ae/wx授粉后15天的胚乳為材料進(jìn)行寡聚核苷酸表達(dá)譜芯片分析。與B73相比,sh1突變體中2706個(gè)探針對(duì)發(fā)生顯著變化,ae/wx突變體中1966個(gè)探針對(duì)發(fā)生顯著變化(FDR

3、<0.1％；q value<0.01)(玉米探針總量17,622個(gè),檢測(cè)13,495個(gè)基因)。為減少玉米自交系背景差異對(duì)基因表達(dá)的影響,分析了B73和Mo17授粉后13天和19天的胚乳中基因表達(dá)的差異,分別找到差異基因609個(gè)和889個(gè)(FDR<5％),認(rèn)為是由遺傳背景差異造成的,從ae/wx vs.B73中扣除了351個(gè),從sh1 vs.B73中扣除390個(gè),分別剩下1429(命名為Dae/wx)和1557(命名為Dsh1)個(gè)差異表達(dá)

4、基因進(jìn)行后續(xù)的分析,其中共同變化的835個(gè)。qRT-PCR結(jié)果表明,90.6％(29/32)的差異基因是可靠的。 2.差異基因的GO分析 Dae/wx中按p-value(<0.1)由小到大依次為脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)(6/12,指該芯片中參與脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的12個(gè)成員中6個(gè)成員表達(dá)變化,下同)、丙酮酸脫羧酶(4/6)、糖類(lèi)運(yùn)輸(4/7)和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分(3/6),說(shuō)明對(duì)碳水化合物代謝和脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)影響顯著；Dsh1中按p-value(<0.1)

5、由小到大依次為糖類(lèi)運(yùn)輸(6/7)、高爾基體(4/5)、蔗糖合成酶(4/6)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(5/9)、脂類(lèi)運(yùn)輸(5/12)、細(xì)胞壁成分(6/18)和丙酮酸脫羧酶(3/6),說(shuō)明除碳水化合物代謝和脂類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)影響顯著外,半胱氨酸蛋白酶抑制劑的表達(dá)降低反應(yīng)了脅迫和細(xì)胞發(fā)育的變化,說(shuō)明該突變體中可能有更多基因表達(dá)變化和細(xì)胞學(xué)改變。 3.差異基因的功能注釋和分類(lèi) 約72％的差異基因得到注釋并按照代謝途徑和功能分為14類(lèi),碳水化

6、合物和能量代謝、基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白質(zhì)合成、蛋白調(diào)控和分子伴侶、脅迫/防御/衰老及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)是受影響很大的代謝和調(diào)控過(guò)程,占共同變化基因的46.5％,占ae/wx單獨(dú)變化基因的53.7％,占shl單獨(dú)變化基因的47.1％。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),與淀粉生物合成相關(guān)的基因變化不多,而與糖中間代謝和能量相關(guān)的基因變化較多；TPS表達(dá)的降低反應(yīng)了淀粉合成基因sh2翻譯后AGPase活性下調(diào)。啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn),參與糖代謝的多數(shù)基因的啟動(dòng)子中有糖響應(yīng)

7、元件。Pul和TPS可能是直接受高糖抑制表達(dá)的基因,而且SREATMSD (TTATCC) 、TATCCAOSAMY (TATCCA) 和 TATCCAYMOTIFOSRAMY3D(TATCCAY)3個(gè)糖抑制元件可能是下調(diào)基因表達(dá)的糖抑制位點(diǎn)。 兩個(gè)突變體中基因表達(dá)的不同變化反應(yīng)了淀粉積累和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異。突變體中糖的積累,可能形成了糖信號(hào)和脅迫信號(hào),改變了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),引起激素響應(yīng)和細(xì)胞組成蛋白的變化,改變了細(xì)胞周期。另外,還發(fā)現(xiàn)

8、母性遺傳基因和種子成熟相關(guān)基因的變化。 4.碳水化合物代謝基因和細(xì)胞周期基因隨胚乳發(fā)育的變化 以B73、ae/wx、sh1授粉后7天種子、15天和25天胚乳為材料,分析18個(gè)糖代謝差異基因和9個(gè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的差異基因的表達(dá)模式,研究發(fā)現(xiàn)sh1突變體中Pul、SBE IIa、UGPase、SUS3和SS IIa基因表達(dá)模式發(fā)生改變,ae/wx突變體中Sh2-1、SUS3和SS IIa基因表達(dá)模式發(fā)生改變,揭示了突變體對(duì)

9、這些基因的巨大影響,反映了它們可能存在相互作用。糖轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)調(diào)節(jié)相關(guān)基因只改變胚乳發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)量而不改變表達(dá)模式,可能是隨著糖的積累、細(xì)胞的發(fā)育等過(guò)程表達(dá)水平發(fā)生了改變。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平發(fā)生了較明顯改變,但是它們的表達(dá)模式?jīng)]有明顯變化,表明雖然突變體中可能促進(jìn)了細(xì)胞分裂但并未打亂細(xì)胞周期,只是延長(zhǎng)了細(xì)胞分裂時(shí)間,延緩了胚乳細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程。徒手切片顯示突變體7天胚乳沒(méi)有明顯的分層,ae/wx突變體細(xì)胞核明顯變大而細(xì)胞大小差異不明

10、顯,sh1突變體細(xì)胞核明顯變小,細(xì)胞數(shù)目增加,說(shuō)明突變體胚乳細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯改變。 5.淀粉生物合成基因的不同貢獻(xiàn) 以Q319、C7-2、q404、ZN-A和S8自交系的幼葉、成熟葉、成熟子房、授粉后1d、5d、10d的種子和15d、20d、25d的胚乳為材料,研究了參與淀粉合成的44個(gè)基因的表達(dá)模式,研究發(fā)現(xiàn)ZmGBSS I、ZmSS Ⅲ、ZmSBE IIb、ZmBT2-2、ZmSH2-2、ZmSh2-3、ZmBT1在胚乳

11、發(fā)育中后期特異性表達(dá),ZmSUS1、ZmSus1L、ZmSUS3、ZmSS I、ZmSS IIa、ZmSBE I、ZmISO1、ZmPul的表達(dá)在淀粉合成期顯著上調(diào),ZmUGP3和ZmSUT2在所有組織中高水平表達(dá),說(shuō)明這些基因可能主要負(fù)責(zé)胚乳淀粉的生物合成。盡管ZmBT2-1和ZmSh2-1隨著胚乳發(fā)育表達(dá)下調(diào),但是一直有較高水平。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),ZmSUS1、ZmSUS1L、ZmBT2-1、ZmSH2-1、ZmBT1、ZmSS、Zm

12、SBE、ZmISO1、ZmISO2、ZmPUL、ZmGPT和ZmPPT定位于質(zhì)體,ZmSUS2、ZmSUS3、ZmUGPase、ZmBT2-2、ZmSH2-2、ZmSH2-3、ZmPGI和ZmPPM定位于細(xì)胞質(zhì)中,而ZmSUT定位于細(xì)胞質(zhì)膜。這些結(jié)果為胚乳淀粉生物合成研究提供了新資料。 6.RNAi技術(shù)創(chuàng)造高直鏈淀粉玉米 為培育高直鏈淀粉玉米材料,根據(jù)淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)模式及已發(fā)表資料,利用RNAi技術(shù)使轉(zhuǎn)基因玉米S