玉米ae-wx和sh1突變體胚乳基因表達譜的變化和淀粉生物合成的研究.pdf

1、玉米(Zea mays L.ssp.Mays)是食品和飼料的主要來源之一,其淀粉產(chǎn)量和品質(zhì)決定了它在人類生產(chǎn)和生活中的地位。為深入了解玉米淀粉合成的分子調(diào)控機理,本研究首先以B73、ae/wx和sh1授粉后15天的胚乳為材料,利用18K Affymetrix玉米基因組芯片平臺,研究了突變體材料中基因表達譜的變化,發(fā)現(xiàn)了淀粉合成受阻后糖的積累對其它物質(zhì)代謝和基因表達調(diào)控的影響；在此基礎(chǔ)上,對可能參與淀粉合成的基因以多個自交系為材料,分析它

2、們在葉片和胚乳發(fā)育過程中的表達模式,研究了不同成員對胚乳淀粉合成的貢獻。同時,為滿足工業(yè)上對高直鏈淀粉的需求,利用RNAi策略敲除ZmSBE IIb或ZmSBE I & ZmSBE IIb。主要結(jié)果如下： 1.胚乳基因表達譜分析 以B73、sh1、ae/wx授粉后15天的胚乳為材料進行寡聚核苷酸表達譜芯片分析。與B73相比,sh1突變體中2706個探針對發(fā)生顯著變化,ae/wx突變體中1966個探針對發(fā)生顯著變化(FDR

3、<0.1％；q value<0.01)(玉米探針總量17,622個,檢測13,495個基因)。為減少玉米自交系背景差異對基因表達的影響,分析了B73和Mo17授粉后13天和19天的胚乳中基因表達的差異,分別找到差異基因609個和889個(FDR<5％),認為是由遺傳背景差異造成的,從ae/wx vs.B73中扣除了351個,從sh1 vs.B73中扣除390個,分別剩下1429(命名為Dae/wx)和1557(命名為Dsh1)個差異表達

4、基因進行后續(xù)的分析,其中共同變化的835個。qRT-PCR結(jié)果表明,90.6％(29/32)的差異基因是可靠的。 2.差異基因的GO分析 Dae/wx中按p-value(<0.1)由小到大依次為脂類轉(zhuǎn)運(6/12,指該芯片中參與脂類轉(zhuǎn)運的12個成員中6個成員表達變化,下同)、丙酮酸脫羧酶(4/6)、糖類運輸(4/7)和細胞壁結(jié)構(gòu)成分(3/6),說明對碳水化合物代謝和脂類轉(zhuǎn)運影響顯著；Dsh1中按p-value(<0.1)

5、由小到大依次為糖類運輸(6/7)、高爾基體(4/5)、蔗糖合成酶(4/6)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(5/9)、脂類運輸(5/12)、細胞壁成分(6/18)和丙酮酸脫羧酶(3/6),說明除碳水化合物代謝和脂類轉(zhuǎn)運影響顯著外,半胱氨酸蛋白酶抑制劑的表達降低反應(yīng)了脅迫和細胞發(fā)育的變化,說明該突變體中可能有更多基因表達變化和細胞學改變。 3.差異基因的功能注釋和分類 約72％的差異基因得到注釋并按照代謝途徑和功能分為14類,碳水化

6、合物和能量代謝、基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白質(zhì)合成、蛋白調(diào)控和分子伴侶、脅迫/防御/衰老及物質(zhì)轉(zhuǎn)運是受影響很大的代謝和調(diào)控過程,占共同變化基因的46.5％,占ae/wx單獨變化基因的53.7％,占shl單獨變化基因的47.1％。進一步分析發(fā)現(xiàn),與淀粉生物合成相關(guān)的基因變化不多,而與糖中間代謝和能量相關(guān)的基因變化較多；TPS表達的降低反應(yīng)了淀粉合成基因sh2翻譯后AGPase活性下調(diào)。啟動子分析發(fā)現(xiàn),參與糖代謝的多數(shù)基因的啟動子中有糖響應(yīng)

7、元件。Pul和TPS可能是直接受高糖抑制表達的基因,而且SREATMSD (TTATCC) 、TATCCAOSAMY (TATCCA) 和 TATCCAYMOTIFOSRAMY3D(TATCCAY)3個糖抑制元件可能是下調(diào)基因表達的糖抑制位點。 兩個突變體中基因表達的不同變化反應(yīng)了淀粉積累和細胞結(jié)構(gòu)的差異。突變體中糖的積累,可能形成了糖信號和脅迫信號,改變了信號轉(zhuǎn)導,引起激素響應(yīng)和細胞組成蛋白的變化,改變了細胞周期。另外,還發(fā)現(xiàn)

8、母性遺傳基因和種子成熟相關(guān)基因的變化。 4.碳水化合物代謝基因和細胞周期基因隨胚乳發(fā)育的變化 以B73、ae/wx、sh1授粉后7天種子、15天和25天胚乳為材料,分析18個糖代謝差異基因和9個細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的差異基因的表達模式,研究發(fā)現(xiàn)sh1突變體中Pul、SBE IIa、UGPase、SUS3和SS IIa基因表達模式發(fā)生改變,ae/wx突變體中Sh2-1、SUS3和SS IIa基因表達模式發(fā)生改變,揭示了突變體對

9、這些基因的巨大影響,反映了它們可能存在相互作用。糖轉(zhuǎn)運、信號調(diào)節(jié)相關(guān)基因只改變胚乳發(fā)育過程中的表達量而不改變表達模式,可能是隨著糖的積累、細胞的發(fā)育等過程表達水平發(fā)生了改變。細胞周期調(diào)節(jié)基因表達水平發(fā)生了較明顯改變,但是它們的表達模式?jīng)]有明顯變化,表明雖然突變體中可能促進了細胞分裂但并未打亂細胞周期,只是延長了細胞分裂時間,延緩了胚乳細胞發(fā)育進程。徒手切片顯示突變體7天胚乳沒有明顯的分層,ae/wx突變體細胞核明顯變大而細胞大小差異不明

10、顯,sh1突變體細胞核明顯變小,細胞數(shù)目增加,說明突變體胚乳細胞結(jié)構(gòu)明顯改變。 5.淀粉生物合成基因的不同貢獻 以Q319、C7-2、q404、ZN-A和S8自交系的幼葉、成熟葉、成熟子房、授粉后1d、5d、10d的種子和15d、20d、25d的胚乳為材料,研究了參與淀粉合成的44個基因的表達模式,研究發(fā)現(xiàn)ZmGBSS I、ZmSS Ⅲ、ZmSBE IIb、ZmBT2-2、ZmSH2-2、ZmSh2-3、ZmBT1在胚乳

11、發(fā)育中后期特異性表達,ZmSUS1、ZmSus1L、ZmSUS3、ZmSS I、ZmSS IIa、ZmSBE I、ZmISO1、ZmPul的表達在淀粉合成期顯著上調(diào),ZmUGP3和ZmSUT2在所有組織中高水平表達,說明這些基因可能主要負責胚乳淀粉的生物合成。盡管ZmBT2-1和ZmSh2-1隨著胚乳發(fā)育表達下調(diào),但是一直有較高水平。亞細胞定位發(fā)現(xiàn),ZmSUS1、ZmSUS1L、ZmBT2-1、ZmSH2-1、ZmBT1、ZmSS、Zm

12、SBE、ZmISO1、ZmISO2、ZmPUL、ZmGPT和ZmPPT定位于質(zhì)體,ZmSUS2、ZmSUS3、ZmUGPase、ZmBT2-2、ZmSH2-2、ZmSH2-3、ZmPGI和ZmPPM定位于細胞質(zhì)中,而ZmSUT定位于細胞質(zhì)膜。這些結(jié)果為胚乳淀粉生物合成研究提供了新資料。 6.RNAi技術(shù)創(chuàng)造高直鏈淀粉玉米 為培育高直鏈淀粉玉米材料,根據(jù)淀粉合成相關(guān)基因的表達模式及已發(fā)表資料,利用RNAi技術(shù)使轉(zhuǎn)基因玉米S