蓖麻毒素A鏈及其突變體的表達(dá)、純化和分析.pdf

1、蓖麻毒素(ricintoxin，RT)為一種植物來源的、毒性強的蛋白質(zhì)毒素，其全毒素是由A、B兩條多肽鏈(RTA、RTB)和連接兩鏈的二硫鍵組成的異二聚體，分子量在62000～66000Da之間。由于毒性強、易于獲得和可氣溶膠化等特點，RT已成為重要的生物戰(zhàn)劑和生物毒素恐怖劑之一。 本實驗首先根據(jù)RTA鏈中已明確的關(guān)鍵性氨基酸殘基位點，設(shè)計了三個突變體RTA(mRTA)旨在降低RTA的毒性和消除RTA鏈易發(fā)生血管滲漏綜合征弊端，

2、即mRTAD75AV76MY80A、mRTAD75AV76MY123A和mRTAD75AV76ME177D(以下簡稱mRTAY80A，mRTAY123A，mRTAE177D)。經(jīng)Lasergene軟件包中Protean程序分析和預(yù)測，它們的氨基酸親水性、抗原指數(shù)和表面可及性預(yù)測圖譜與非突變體(RTA)蛋白的預(yù)測圖譜基本一致，說明mRTAY80A、mRTAY123A和mRTAE177D三個mRTA的抗原性未發(fā)生變化。 然后以含RT

3、A基因的pUC19-RTA為模板，通過PCR方法擴增出RTA基因，又通過定點突變技術(shù)獲得三種mRTA基因，即mRTAY80A，mRTAY123A，mRTAE177D。上述基因分別連接至pMD18-T載體進(jìn)行序列分析鑒定，結(jié)果表明，PCR擴增的RTA基因序列與GenBank中所報道的RTA基因序列完全一致；三個mRTA基因也按照預(yù)先設(shè)計要求發(fā)生了相應(yīng)的突變。然后以EcoRⅠ和NheⅠ對pMD18-TRTA、pMD18-TmRTAY80A、

4、pMD18-TmRTAY123A、pMD18-TmRTAE177D和原核表達(dá)載體pET-His進(jìn)行雙酶切，按常規(guī)方法進(jìn)行連接，獲得四個重組表達(dá)質(zhì)粒pET-HisRTA、pET-HismRTAY80A，pET-HismRTAY123A，pET-HismRTAE177D。經(jīng)過雙酶切和PCR鑒定正確后，分別轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)plysS感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建了4個相應(yīng)的表達(dá)工程菌。分別在30℃、37℃，經(jīng)0.4mMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)

5、2～4h后，4個表達(dá)工程菌的SDS-PAGE分析顯示，均有一條相對分子量約32kDa的表達(dá)蛋白區(qū)帶，與RTA相對分子量相符。其中，重組RTA(rRTA)蛋白呈現(xiàn)可溶性表達(dá)和包涵體表達(dá)兩種形式，且rRTA蛋白可溶性的表達(dá)量約占全菌蛋白的18.45％；其余三個mRTA蛋白均為包涵體形式，目的蛋白表達(dá)量依次為17.21％、26.22％、32.79％。 根據(jù)重組蛋白N端帶有6×His標(biāo)簽的特征，用螯合鎳離子次氨基三乙酸(Ni-NTA)的

6、親和層析柱對重組蛋白進(jìn)行一步純化。其中，在非變性條件下rRTA經(jīng)咪唑濃度梯度洗脫，目的蛋白在含100mM咪唑的洗脫液中被洗脫下來，經(jīng)TotalLab2.0圖像軟件分析純化蛋白的純度達(dá)97.53％左右，1L工程菌培養(yǎng)液可純化到約18mg的rRTA蛋白；在變性條件下，三種mRTA蛋白經(jīng)pH梯度洗脫，結(jié)果目的蛋白在pH4.0的洗脫液中被洗脫下來，三種mRTA蛋白的純度在76.2％～89.5％之間，1L工程菌培養(yǎng)液可純化到的mRTA蛋白約在42

7、.75mg～50.59mg之間。經(jīng)Western印跡分析，rRTA蛋白和三種重組mRTA蛋白均可被鼠抗天然蓖麻毒素多克隆抗體識別，說明表達(dá)和純化的目的蛋白是正確的，并均具有良好的抗原性。這為以三種mRTA蛋白為基礎(chǔ)進(jìn)行RT疫苗的研制奠定了必要的基礎(chǔ)。 此外，用rRTA蛋白免疫昆明小鼠，經(jīng)兩次加強免疫后，免疫鼠血清的ELISA效價達(dá)到1×10-6以上，并且在體外中和試驗中，該血清具有中和天然RT的作用，表明rRTA能引起小鼠正常的