基于TILING的小麥淀粉合成關(guān)鍵基因突變體發(fā)掘與發(fā)達(dá)分析.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)利用EMS構(gòu)建了小麥品種京411的M2代突變?nèi)后w，并從Agp2B、Wx-A1、SSⅡ-A、SSⅡ-B和SBE1等5個(gè)淀粉合成關(guān)鍵基因中篩選獲得多個(gè)點(diǎn)突變。在此基礎(chǔ)上，本研究利用TILLING技術(shù)篩選SSⅣ基因的突變體，并在M3代檢測(cè)SSⅣ以及Agp2B、Wx-A1、SSⅡ-A、SSⅡ-B、SBE1等6個(gè)基因的點(diǎn)突變對(duì)其基因表達(dá)水平和籽粒淀粉含量的影響。主要結(jié)果如下:
　　1.利用TILING技術(shù)篩選京411的M2代突變

2、群體，獲得SSⅣ基因的54個(gè)點(diǎn)突變，SSⅣ基因在群體中的突變密度為1/198.82kb。其中1個(gè)無(wú)義突變、2個(gè)剪接突變和22個(gè)錯(cuò)義突變。無(wú)義突變C2188T，使相應(yīng)肽鏈在第269位提前終止。2個(gè)剪接突變均發(fā)生在第7內(nèi)含子第一個(gè)堿基，即第3825位，G轉(zhuǎn)換為A。22個(gè)錯(cuò)義突變中，PARSENP預(yù)測(cè)T1991C、C2254Y、C4061T和G6438A可能將嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)功能。
　　2.選擇預(yù)測(cè)可能影響蛋白質(zhì)功能的13個(gè)SSⅣ基因突變

3、單株繁殖成M3代，包括1個(gè)無(wú)義突變，2個(gè)剪接突變和10個(gè)錯(cuò)義突變。無(wú)義突變的M3代純合單株中SSⅣ基因的表達(dá)非常微弱，可能無(wú)義突變使相應(yīng)mRNA因提前終止翻譯而被降解。剪接突變的M3代純合單株中檢測(cè)到5種不同的mRNA剪接方式:保留第6、7、8內(nèi)含子，保留第7、8內(nèi)含子，保留第7內(nèi)含子，第7外顯子隨第6、7內(nèi)含子被切除，第7、8外顯子與第6、7、8內(nèi)含子一起被切除。5種剪接方式均改變了SSⅣ因的讀碼框，提前產(chǎn)生終止密碼子使其蛋白質(zhì)產(chǎn)物丟

4、失C-端的ADP結(jié)合位點(diǎn)，可能喪失催化功能。
　　3.檢測(cè)M3代的Agp2B基因，獲得6個(gè)錯(cuò)義突變。其中A422、E2-2-427、E3-1-3等3個(gè)突變系的Agp2B基因表達(dá)量在籽粒發(fā)育不同時(shí)期顯著降低，E3-1-3株系的籽粒淀粉含量顯著下降9.1％。Agp2B基因在開(kāi)花后24天仍然維持較高的表達(dá)水平，表明該基因可能在灌漿后期對(duì)維持AGPase酶活性，促進(jìn)籽粒淀粉合成有重要作用。
　　4.在M3代檢測(cè)Wx-A1基因的6個(gè)點(diǎn)

5、突變、SSⅡ-A基因的12個(gè)點(diǎn)突變以及SSⅡ-B和SBE1基因各3個(gè)點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)Wx-A1和SSⅡ-B基因的所有點(diǎn)突變、SSⅡ-A基因的3個(gè)錯(cuò)義突變可以穩(wěn)定遺傳，而SSⅡ-A基因的其他9個(gè)點(diǎn)突變以及SBE1基因的所有點(diǎn)突變沒(méi)有在后代檢測(cè)到。未檢測(cè)到突變的可能原因是突變的分離比較小，也可能在M3代回復(fù)突變或者丟失。
　　以上研究證實(shí)，采用TILLING技術(shù)檢測(cè)獲得的點(diǎn)突變可在后代穩(wěn)定遺傳，并影響基因的表達(dá)及相關(guān)表型，這些突變材料可進(jìn)