Survivin反義寡核苷酸對(duì)嬰幼兒增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、嬰幼兒血管瘤是嬰幼兒期最常見(jiàn)的良性腫瘤，發(fā)病率高達(dá)10~12％，男女比例1:3~5。血管瘤有其獨(dú)特的自然病史：出生后或生后不久出現(xiàn)并迅速增大，經(jīng)6月~1年增生期后進(jìn)入消退期，至7~8歲90%可自然消退。血管瘤增生、消退的確切機(jī)制，目前還不完全清楚。大量研究顯示，血管瘤的增生和消退可能是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡失衡所造成的。但到目前為止，關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制亦尚不完全明確。Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的、迄今為止最強(qiáng)的凋亡抑

2、制因子，有研究表明及本課題前期研究發(fā)現(xiàn) Survivin蛋白在增生期血管瘤組織中高表達(dá)，并且定位于內(nèi)皮細(xì)胞；而在消退期血管瘤組織中低表達(dá)或不表達(dá)，且其有可能通過(guò)抑制Caspase-3活性以干擾內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其增殖。若能干擾Survivin蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)有望控制內(nèi)皮細(xì)胞增生，誘導(dǎo)其凋亡。本研究采用Survivin ASODN抑制靶基因表達(dá)的策略，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，將Survivin ASODN導(dǎo)入體外培養(yǎng)的增殖期血

3、管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell，VEC)，研究Survivin ASODN對(duì)靶細(xì)胞的影響以揭示Survivin基因在血管瘤增生和消退機(jī)制中的作用，探討Survivin ASODN在治療增殖期血管瘤中的意義，為進(jìn)一步開(kāi)展臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分嬰幼兒增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定及生長(zhǎng)狀況的觀察
　　研究目的：探討體外分離培養(yǎng)和純化嬰幼兒增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的方法，對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)

4、胞進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì)鑒定并檢測(cè)其純度，初步觀察所培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　研究方法：收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的15例新鮮嬰幼兒血管瘤（按Mulliken標(biāo)準(zhǔn)，組織病理結(jié)果均為增生期血管瘤），無(wú)菌條件下立即放置于含有M199培養(yǎng)液的培養(yǎng)管中，放置于4℃冰盒中保存，運(yùn)至細(xì)胞培養(yǎng)室，采用組織塊法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)成功后，在相差顯微鏡下刮除非內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞鋪滿瓶底，并進(jìn)行傳代，同時(shí)運(yùn)用反復(fù)貼壁法及酶消化法行數(shù)次純

5、化，取第4代內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)用免疫組化法對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定并檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞純度。對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　研究結(jié)果：15例標(biāo)本均成功培養(yǎng)出血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)為較規(guī)則的圓形、橢圓形或多角形，核居中，部分可見(jiàn)核分裂相及雙核，細(xì)胞境界清晰，細(xì)胞融合后呈現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特有“鋪路石”特征。細(xì)胞免疫組化鑒定：第Ⅷ因子相關(guān)抗原、CD31、CD34均為陽(yáng)性，證實(shí)為內(nèi)皮細(xì)胞，檢測(cè)純度為CD34(+)數(shù)為68.35%士3.58

6、%，所培養(yǎng)的細(xì)胞具有“管腔形成”現(xiàn)象。細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制的第3代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示：細(xì)胞數(shù)量在接種后6~7天左右進(jìn)入快速增殖期，第10天左右細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高值，此后細(xì)胞數(shù)量進(jìn)入穩(wěn)定期。第7代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示：細(xì)胞數(shù)量在接種后3~4天左右進(jìn)入快速增殖期，約第6~7天左右細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高值，此后細(xì)胞數(shù)量進(jìn)入穩(wěn)定期。最多傳至第9代，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落，大部分細(xì)胞體積縮小，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，脫壁懸浮細(xì)胞增多，生長(zhǎng)緩慢難以繼續(xù)培養(yǎng)傳代。
　　

7、研究結(jié)論：采用組織塊法可以分離培養(yǎng)嬰幼兒增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)鑒定為內(nèi)皮細(xì)胞，具有內(nèi)皮細(xì)胞特有“鋪路石”特征，而且還具有血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞特有的“管腔形成”現(xiàn)象。傳代后細(xì)胞純度較高，可以滿足相關(guān)實(shí)驗(yàn)需要。
　　第二部分嬰幼兒增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞 Survivin基因表達(dá)狀況的研究
　　研究目的：運(yùn)用 RT-PCR、Western-blot法和免疫組化法檢測(cè)所培養(yǎng)的嬰幼兒增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞Survivin mRNA、

8、Survivin蛋白表達(dá)水平。
　　研究方法：將傳代的第4代增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)1周至80~90%融合后，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA混合消化液消化細(xì)胞，離心(1200r/min，5min)收集細(xì)胞，并制作細(xì)胞爬片，通過(guò) RT-PCR法、Western-blot法和免疫組化法檢測(cè)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞Survivin mRNA、Survivin蛋白表達(dá)水平。研究結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)顯示Survivin

9、mRNA片段大小為338bp，β-actin為600bp，與理論值相符，Survivin mRNA表達(dá)強(qiáng)度為0.778±0.040。Western-blot顯示Survivin蛋白分子量大小為16.5KD，β-actin為42.0KD，與理論值相符。Survivin蛋白表達(dá)強(qiáng)度為0.820±0.026。免疫組化顯示Survivin蛋白表達(dá)量為6.80±0.82分，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。
　　研究結(jié)論：Survivin基因在嬰幼兒增生期血管

10、瘤內(nèi)皮細(xì)胞中有表達(dá)
　　第三部分 Survivin反義寡核苷酸對(duì)嬰幼兒增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　研究目的：1、研究Survivin ASODN轉(zhuǎn)染后體外培養(yǎng)的嬰幼兒增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin基因的表達(dá)及Caspase-3活性表達(dá)。
　　2、初步探討Survivin ASODN對(duì)嬰幼兒增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制。
　　研究方法：針對(duì)Survivin mRNA翻譯起始位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成反

11、義寡核苷酸，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的嬰幼兒增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，采用 RT-PCR、Western-blot和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞Survivin mRNA、Survivin蛋白表達(dá)及Caspase-3活性表達(dá)。同時(shí)測(cè)定轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，研究Surivin反義寡核昔酸對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制。
　　研究結(jié)果：1、隨著Survivin ASODN濃度增加，Survivin

12、mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，其差異具有顯著性，其中Survivin ASODN濃度為600nM、作用72h時(shí) Survivin mRNA抑制率達(dá)80.38%±0.02%，效果最佳；隨著Survivin ASODN濃度增加，細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)亦下降。
　　2、 Caspase-3活性分析發(fā)現(xiàn)，Survivin ASODN-脂質(zhì)體復(fù)合物分別作用于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞24、48h、72h后，Caspase-3被不同程度的激活，Caspa

13、se-3蛋白表達(dá)量皆不同程度的上調(diào)，與各對(duì)照組比較差異均有顯著性（p<0.05）。Survivin ASODN濃度為600nM、作用48h時(shí)對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3蛋白的上調(diào)程度最大。
　　3、 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Survivin ASODN對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用隨濃度增大而增強(qiáng)。
　　4、倒置相差顯微鏡觀察顯示：實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染ASODN后的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落；大部分細(xì)胞體積縮小，貼壁細(xì)

14、胞數(shù)量減少，脫壁懸浮細(xì)胞增多，生長(zhǎng)緩慢。其中ASODN濃度為600nmol/L、作用72h時(shí)此種改變最顯著。
　　5、 HE染色顯示：實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染 ASODN后的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞多數(shù)變圓、變小，細(xì)胞核固縮、碎裂，核被染成深藍(lán)色或藍(lán)黑色；細(xì)胞膜皺褶、卷曲，符合細(xì)胞凋亡征象。各對(duì)照組細(xì)胞仍保持原有的生長(zhǎng)形狀，細(xì)胞核規(guī)整，染成均一藍(lán)色，胞漿呈淡紅色。
　　研究結(jié)論：1、Survivin ASODN體外轉(zhuǎn)染后可明顯下調(diào)嬰幼兒增生期血管瘤