小麥轉(zhuǎn)錄因子基因TaNF-YB21耐逆功能及TaZFP1～TaZFP4遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs）在調(diào)控植物應(yīng)答和抵御生物和非生物逆境，生長發(fā)育及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。核因子Y(Nuclear Factor Y，NF-Y)是一類典型的通過與真核生物啟動(dòng)子區(qū)的CCAAT-box相結(jié)合從而對(duì)下游基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。本項(xiàng)研究以在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的富集干旱脅迫的小麥根系cDNA差減文庫中獲得的NF-Y型轉(zhuǎn)錄因子TaNF-YB2;1的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)為基礎(chǔ)，系統(tǒng)

2、研究了該基因的分子特征、干旱鹽分逆境下的表達(dá)特性及其介導(dǎo)植株抵御干旱及鹽分等非生物逆境的生物學(xué)功能。近年來許多研究表明，C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答和抵御非生物逆境的過程中也發(fā)揮了重要作用。本研究構(gòu)建了C2H2型轉(zhuǎn)錄因子基因TaZFP1～TaZFP4的正、反義雙元表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)建立了正、反義序列轉(zhuǎn)基因煙草植株。為進(jìn)一步深入研究-C2H2型轉(zhuǎn)錄因子家族成員的作用機(jī)制和生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:<

3、br>　　1.在富集干旱逆境的小麥根系cDNA差減文庫中，經(jīng)測序獲得1個(gè)與短柄草核轉(zhuǎn)錄因子NF-YB2-like高度同源的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，進(jìn)一步在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST序列同源查找獲得與該EST序列對(duì)應(yīng)的cDNA序列，將其命名為TaNF-YB2;1。該基因的cDNA全長為958 bp，編碼長度為163個(gè)氨基酸的多肽鏈，編碼蛋白的分子量為17.74 kD，等電點(diǎn)(pI)為6.13。此外，該基因編碼蛋白含有植物種屬NF-YB2家

4、族成員具有的4個(gè)保守α螺旋基序，分別為α1(DRFLPIANISR)、α2(KETLQECVSEFIS)、α3(DDLLWAMATLG)和αC(PLKIYL)。
　　2.在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST同源查找獲得23個(gè)其它不同植物種屬的TaNF-YB2;1同源基因。利用DNAStar軟件建立上述同源基因與TaNF--YB2;1的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，TaNF-YB2;1在核酸水平上與小麥NFYB-B2、短柄草NF-YB2-like和

5、水稻OsHAP3A基因的一致性較高，分別為97.1％、80.7％和70.7％，說明TaNF-YB2;1可能與上述基因具有相似的進(jìn)化關(guān)系或相似祖先。
　　3.對(duì)TaNF-YB2;1在正常生長及干旱和鹽分處理下小麥根系中的表達(dá)特征進(jìn)行研究。結(jié)果表明，干旱和鹽分逆境能使該基因的表達(dá)量明顯上升，TaNF-YB2;1在介導(dǎo)植株抵御上述逆境的過程中可能發(fā)揮著重要生物學(xué)功能。
　　4.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草(cv.Wisco

6、nsin38)，獲得超表達(dá)TaNF-YB2;1的轉(zhuǎn)基因煙草植株。選用典型TaNF-YB2;1轉(zhuǎn)基因煙草系和野生型煙草為材料，研究了干旱、鹽分滲透脅迫下植株的生長特征和干物質(zhì)積累量。結(jié)果表明，在干旱和鹽分條件下，TaNF-YB2;1轉(zhuǎn)基因植株生長得到明顯改善，植株形態(tài)明顯增大，干物質(zhì)累積量顯著增加。表明，遺傳轉(zhuǎn)化TaNF-YB2;1具有明顯改善植株抵御干旱和鹽分滲透脅迫的能力。
　　5.以遺傳轉(zhuǎn)化TaNF-YB2;1的正義第二系(S

7、en-2)和反義第一系(Ant-1)及野生型(WT)植株為材料，對(duì)干旱、鹽分條件下植株體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)3種細(xì)胞保護(hù)酶、磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NTPT)及硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NTNRT）相關(guān)基因的表達(dá)特征及相關(guān)生理活動(dòng)參數(shù)的變化特點(diǎn)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，與野生型(WT)植株相比，干旱和鹽分脅迫后，TaNF-YB2;1轉(zhuǎn)基因煙草植株的Sen-2系SOD和CAT相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量部分明顯上升，P

8、OD相關(guān)基因的表達(dá)量大多呈下降趨勢;其SOD活性、CAT活性和可溶性蛋白含量均明顯增高，但POD活性和MDA含量明顯低于野生型植株，而Ant-1系變化趨勢大多與Sen-2系相反或與野生型(WT)植株相比無明顯變化。NTPT和NTNRT相關(guān)基因中僅個(gè)別基因在Sen-2系和Ant-1系中的表達(dá)量發(fā)生明顯改變。表明TaNF-YB2;1在介導(dǎo)植株抵御干旱和鹽分逆境的過程中，對(duì)植株體內(nèi)上述3種細(xì)胞保護(hù)酶、磷酸鹽和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控

9、，導(dǎo)致部分生理生化參數(shù)也發(fā)生明顯變化，在植物體內(nèi)彼此之間相互影響形成一個(gè)極其復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使轉(zhuǎn)基因植株在上述逆境下能更好的生長。
　　6.干旱和鹽分處理后，用DAB和NBT分別定位Sen-2系和Ant-1系及野生型植株葉片中的H2O2和O2-·。結(jié)果表明，Sen-2系植株在上述逆境下葉片著色均比WT淺，清除活性氧H2O2和O2-·的能力增強(qiáng);而Ant-1系植株葉片除在鹽分處理下NBT染色略淺于WT外其余均比WT著色深，清除活性氧H

10、2O2和O2-·的能力較弱。
　　7.通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的富集低磷脅迫不同時(shí)間點(diǎn)根系特異表達(dá)的cDNA差減文庫的部分克隆測序，獲得了4個(gè)C2H2型轉(zhuǎn)錄因子的ESTs。進(jìn)一步同源查找，得到與上述ESTs在核苷酸序列一致的小麥cDNA序列(GenBank登錄號(hào)分別為AK331121、AK333490、AK334138和AK333024)，本文將其命名為TaZFP1～TaZFP4。其cDNA全長分別為708 bp、1507 bp、16

11、12 bp和940 bp，編碼的氨基酸數(shù)目分別為124個(gè)、400個(gè)、383個(gè)和119個(gè)。TaZFP1～TaZFP4的分子量分別為13.96 kD、45.01kD、44.09kD、12.42 kD，等電點(diǎn)(pI)分別為9.3、5.27、7.54、9.97。
　　8.對(duì)TaZFP1～TaZFP4進(jìn)行BLAST同源查找，獲得來自不同植物種屬的同源基因并利用DNAStar建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果分析表明，TaZFP1～TaZFP在核苷酸水平上

12、與源于大麥、短柄草和玉米的同源基因序列高度一致，可能具有較近的親緣關(guān)系。
　　9.對(duì)TaZFP1～TaZFP4在低磷、低氮、干旱、鹽分逆境下的表達(dá)特征進(jìn)行研究，結(jié)果表明上述基因均對(duì)個(gè)別或全部逆境產(chǎn)生應(yīng)答。采用RT-PCR和DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了融合TaZFP1～TaZFP4正、反義序列的雙元表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法建立了遺傳轉(zhuǎn)化正、反義表達(dá)TaZFP1～TaZFP4的轉(zhuǎn)基因煙草株系。為進(jìn)一步鑒定TaZFP1～ TaZFP4介導(dǎo)植