楊樹轉(zhuǎn)錄因子ERF76基因耐鹽功能研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子以反式作用因子的形式與基因啟動子序列中的順式作用元件特異性結(jié)合，通過與其他相關(guān)蛋白之間的互作來激活或者抑制轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。ERF家族基因是一類植物中特有的與植物生長發(fā)育和生物、非生物脅迫應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因。通過RNA-Seq方法篩選楊樹中應(yīng)答鹽脅迫的ERF基因，結(jié)果顯示在所有上調(diào)表達(dá)的ERF家族基因中，轉(zhuǎn)錄因子ERF76基因的相對表達(dá)量變化最顯著。
　　利用RT-qPCR對ERF76基因在3個不同組織和

2、5個不同鹽脅迫時間點(diǎn)的時空表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ERF76基因在根莖葉中均有表達(dá)，在根中相對表達(dá)水平最高，依次是葉和莖，在脅迫3-36 h時間段內(nèi)，該基因在根莖葉中相對表達(dá)水平達(dá)到峰值的時間點(diǎn)均在12h。
　　利用巢式PCR從小黑楊基因組中克隆出ERF76基因上游1.5 kb的DNA序列。元件預(yù)測顯示，ERF76基因啟動子序列中包含轉(zhuǎn)錄、植物脅迫應(yīng)答和植物生長發(fā)育相關(guān)的順式作用元件。利用酵母單雜交鑒定與ERF76基因啟動子互作

3、的蛋白包括轉(zhuǎn)錄、氧化還原酶活性、植物防御和應(yīng)激反應(yīng)、植物生長發(fā)育相關(guān)蛋白。利用RT-qPCR、GUS染色和GUS熒光定量檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥中不同啟動子片段驅(qū)動GUS基因表達(dá)情況，結(jié)果表明不同長度的ERF76啟動子片段具有不同轉(zhuǎn)錄激活活性和應(yīng)答鹽脅迫功能。
　　利用RT-PCR從小黑楊中克隆出1537 bp編碼ERF76基因的cDNA片段。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示ERF76蛋白定位在細(xì)胞核中。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法獲得CaMV35S啟動

4、子驅(qū)動下的ERF76基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因小黑楊。在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因小黑楊的株高、根長、鮮重、抗氧化酶活性、抗逆境保護(hù)分子含量和相對含水量均高于非轉(zhuǎn)基因株系，植物體內(nèi)活性氧的積累和相對電導(dǎo)率均低于非轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因楊樹與野生型楊樹相比具有明顯的表型差異，轉(zhuǎn)基因楊樹中的ABA和GA相對含量明顯高于野生型。轉(zhuǎn)基因楊樹中ERF76基因、一些脅迫相關(guān)基因及植物激素合成相關(guān)基因的mRNA豐度顯著高于非轉(zhuǎn)基因楊樹。轉(zhuǎn)基因楊樹