大豆MBF1轉(zhuǎn)錄輔激活因子基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、干旱，低溫，鹽堿，水澇等逆境脅迫因子是限制植物生長和區(qū)域分布的重要因素，并且嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。轉(zhuǎn)錄因子是起調(diào)控作用的反式作用因子，可以介導(dǎo)植物對逆境脅迫的響應(yīng)，轉(zhuǎn)錄輔激活子能增強轉(zhuǎn)錄因子和順式作用原件的結(jié)合。MBF1即多蛋白橋梁因子，是一個高度保守的轉(zhuǎn)錄輔激活子，通過橋連一個激活子和TATA盒結(jié)合蛋白來介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活。MBF1基因最早是在蠶的后絲腺中被提純的，后來在植物中也發(fā)現(xiàn)了MBF1基因。據(jù)相關(guān)報道，擬南芥，番茄，馬鈴薯等

2、植物的MBF1基因的過表達能增強植株抵抗逆境脅迫的能力，而大豆關(guān)于此基因還沒有相關(guān)的報道。本論文旨在分析大豆MBF1同源基因，開展目標(biāo)基因在二穗短柄草中的過量表達研究，為深入了解大豆MBF1基因的功能提供基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.大豆MBF1基因的克隆與分析
　　通過序列比對與分析，獲得了3個大豆的MBF1同源基因，以大豆葉片的總RNA為模板，體外反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，通過PCR擴增得到429b

3、p大小的三個片段，分別將其命名為GmMBF1-1，GmMBF1-2和GmMBF1-3，三者在氨基酸水平上的序列相似性為99％。將其與擬南芥的MBF1基因進行同源性比較，在氨基酸水平上的序列相似性達到約80％。在系統(tǒng)發(fā)育分析中，這三個MBF1同源基因聚類在一起。基因結(jié)構(gòu)分析表明三個基因在外顯子和內(nèi)含子的數(shù)目和長度上高度保守。
　　2.半定量RT-PCR分析大豆MBF1同源基因的表達特性
　　以大豆Tubulin基因作為內(nèi)參基因

4、進行半定量RT-PCR,分析不同脅迫誘導(dǎo)下GmMBF1-1、GmMBF1-2和GmMBF1-3基因在大豆葉片中的表達特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆3個MBF1基因的表達均可以被NaCl、SA和低溫誘導(dǎo)，GmMBF1-1和GmMBF1-2可以被ABA誘導(dǎo)。
　　3.過量表達載體PC186/GmMBF1-1、PC186/GmMBF1-2和PC186/GmMBF1-3的構(gòu)建
　　驗證的GmMBF1-1、GmMBF1-2和GmMBF1-3基因與

5、入門載體PC414C經(jīng)NotⅠ和AscⅠ酶切后通過T4連接酶連接，連接產(chǎn)物經(jīng)過酶切驗證和測序后與目的載體PC186發(fā)生LR重組反應(yīng)，最終將GmMBF1-1、GmMBF1-2和GmMBF1-3基因連接到目的載體PC186上，構(gòu)成過量表達載體，命名為PC186/GmMBF1-1、PC186/GmMBF1-2和PC186/GmMBF1-3。
　　4.再生短柄草植株的獲得
　　將短柄草種子取幼胚進行誘愈培養(yǎng)，得到愈傷組織之后，通過農(nóng)