根癌農桿菌拮抗真菌的篩選、發(fā)酵及有機錫新化合物抗TMV、抗癌機制研究.pdf

1、本文分為兩個部分。第一部分是針對目前根癌病的生防細菌不耐旱，壽命短的缺點，首次從果樹根系土壤中篩選拮抗根癌農桿菌的生防真菌，并確定生防真菌的發(fā)酵條件，為植物根癌病生防菌株的開發(fā)及應用擴大菌種資源；另一部分是針對目前防止TMV的一般藥劑很難在不傷害寄主的情況下抑制病毒增殖，首次對南開大學李正名院士提供的有機錫新化合物04-W0319進行了抗TMV活性及機制的研究，并在此基礎上對04-W0319的抗腫瘤機制進行了系統(tǒng)研究，為開發(fā)低毒、高效的

2、有機錫新化合物，拓展其應用范圍提供參考依據(jù)。在第一部分的研究中，從我國12個省市采集的土樣中分離純化出152株真菌，采用瓊脂柱初篩，得到2株抗根癌農桿菌Agrobacterium tumefaciens T-37(簡稱 T-37)的真菌菌株，通過濾紙片法進行對比復篩，證實了此2株菌株對根癌農桿菌具有拮抗作用。根據(jù)Raper (1965)關于曲霉屬的分類標準，拮抗1號真菌菌株的主要形態(tài)特征與他所描述的黑曲霉(Aspergillus nig

3、er V.Tieghen 1867)的標準形態(tài)基本相同，鑒定該菌株屬于曲霉屬黑曲霉群的一株黑曲霉，記為黑曲霉xj (Aspergillus niger xj)，并將該菌種保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心。根據(jù)Brown & Smith(1957)的分類標準，拮抗2號菌株鑒定為輪枝擬青霉，記為輪枝擬青霉49-01 (Paecilomyces verticillatus 49-01)，為新種。對xj菌株進行單孢子分離，獲得8個單孢子株，分別記為

4、xj-1、xj-2、xj-3、xj-4、xj-5、xj-6、xj-7、xj-8。通過對菌落生長情況，產孢量、分生孢子的萌發(fā)率、對T-37抑制活性的綜合比較，認為xj-5為優(yōu)勢單孢子株，并對其繼代培養(yǎng)后的培養(yǎng)性狀及對T-37的抑制活性進行了考察，xj-5單孢子株所表現(xiàn)出的遺傳性狀較為穩(wěn)定并且所產生的抑菌圈直徑(20.13±0.09 mm)高于對照xj菌株(18.28±0.21 mm)。以xj-5單孢子株作為出發(fā)菌株，對其發(fā)酵工藝條件進行探

5、索。對培養(yǎng)成分中2％的麥芽糖、葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、甘油6種碳源和3％的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸銨、氯化銨、脲素6種氮源進行單因素篩選，選擇麥芽糖、蔗糖為碳源，酵母膏、蛋白胨為氮源，并設計L9(34)正交實驗對C／N進行優(yōu)化。確定xj-5菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：麥芽糖2％，蔗糖2％，酵母膏3％，蛋白胨1％。對培養(yǎng)條件中的不同接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度及發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH值分別進行了篩選。確定xj-5菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：接種15％

6、、搖瓶裝液量10％、培養(yǎng)溫度25℃、發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH自然。根據(jù)以上篩選出的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，將xj-5菌株接種搖瓶培養(yǎng)，每隔24h定時取樣，測定生物量和抑菌圈直徑，繪制發(fā)酵動態(tài)曲線。結果顯示：xj-5菌株直接進入對數(shù)生長期，無生長延遲期，這可能是因為加入的液體母種活力強，并且培養(yǎng)條件的差異不大，菌株能很快適應發(fā)酵環(huán)境，直接進入快速生長期，并且這段時間較長(1-8d)，生物量在第8天的時候達到了最大(161.24g／L)，同時抑菌成

7、分也在不斷分泌與積累。隨后延遲期(9-12d)持續(xù)了較長的時間，并在當在第10天的時候，代謝產物的累積達到了高峰，抑菌圈直徑達到最大(54.48 mm)。隨著發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)的耗盡，衰老期的出現(xiàn)(13-15d)，毒素的累積及菌體自溶導致生物量急劇下降，而細胞內容物的流出和細胞碎片的產生導致發(fā)酵培養(yǎng)基pH值的變化，直接影響著xj菌株的抑菌成分的活性，以致抑菌圈直徑也急劇下降。因此，根據(jù)xj-5菌株的發(fā)酵動力學的模型，確立xj-5菌株抑菌活性

8、成分的發(fā)酵工藝為：制備麥芽糖2％，蔗糖2％，酵母膏3％，蛋白胨1％，pH自然的發(fā)酵培養(yǎng)基，將xj-5菌株按15％的接種量，接種到裝液量為10％的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃，120rpm，搖瓶培養(yǎng)10d，收集菌絲體制備發(fā)酵濃縮液，濾紙片法測xj-5菌株的抑菌圈直徑達54.48 mm。 第二部分的研究以心葉煙為材料，得到有機錫新化合物04-W0319對煙草花葉病毒侵染的治療效果為49.38％；鈍化效果為73.23％；保護效果為48.8

9、2％。 500μg/L 04-W0319與TMV體外作用30min，電鏡下觀察，顯示病毒粒體出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，粒體結構受到了破壞；瓊脂糖凝膠電泳顯示04-W0319對TMV-RNA具有體外降解作用；TMV-CP的UV測定結果反映了04-W0319對煙草花葉病毒的體外聚合過程具有抑制作用。對普通煙K326的PAL、POD和SOD的活性進行了測定。PAL活性測定結果表明：500μg/L 04-W0319處理的煙苗在第7天達到酶活高峰值，第9天降

10、到最低，并且煙草在接種TMV后再用04-W0319處理可使酶活性增加。POD活性測定結果表明：單獨用04-W0319處理的酶活在第7天達到酶活高峰值，煙草在接種TMV后再用04-W0319處理也可使酶活性增加，在第9天達到酶活高峰值，并高于其它處理。SOD活性測定結果表明：TMV處理的酶活于第5天達到一個高峰值，隨后酶活在第9天又達到另一個高峰值，接種TMV后再用04-W0319處理的與發(fā)病對照的酶活趨勢一致，單獨用0-W0319處理的

11、煙苗酶活在第5天達到高峰值，并高于其它處理組。 K326的胞間蛋白經SDS-PAGE不連續(xù)電泳分析表明：化合物04-W0319對K326的胞間蛋白影響不大，并且對PR蛋白的誘導也不強。 04-W0319對寄主葉綠素含量的影響實驗結果顯示：TMV感染后使得煙草葉片中葉綠素的含量大大降低，04-W0319處理的煙草葉片葉綠素含量有所提高，說明04-W0319能夠減少病毒對煙草葉片中葉綠體的破壞作用，增加了葉綠素的含量，從而提高寄主的抗病性；

12、但藥劑處理煙草葉片的葉綠素含量仍然低于健康對照，這也說明04-W0319不能完全抑制病毒對葉綠素的破壞作用。因此，04-W0319一方面可在體外與TMV作用，降低TMV的侵染率；另一方面可提高寄主防御酶系活性和增加葉綠素含量，提高寄主抗性，抵御TMV的侵染。以PC3、Bcap-37和BGC823腫瘤細胞為材料，04-W0319作用72h對PC3細胞的IC50為0.13 μg／mL：作用48h對Bcap-37細胞的IC50為0.18pg／

13、mL：作用48h對BGC823細胞的IC50為0.17 μg／mL。細胞毒性實驗初步判斷：04-W0319誘導3株細胞死亡主要不是通過細胞毒性。劃痕標記法實驗表明04-W0319可降低3株細胞的運動能力而抑制腫瘤細胞的生長。細胞形態(tài)學觀察及細胞培養(yǎng)液上清中LDH活力測定表明：72h內凋亡始終是04-W0319誘導PC3和Bcap-37細胞死亡采用的主要方式；48 h內凋亡始終是04-W0319誘導BGC823細胞死亡采用的主要方式。流式

14、細胞分析術檢測結果進一步揭示：0.15 μg/mL 04-W0319作用48h，將PC3或Bcap-37細胞阻滯在G2／M期而抑制細胞的生長、繁殖；當作用時間延長或作用濃度增高時，以誘導細胞發(fā)生凋亡為主；對BGC823細胞，0.15 μg／mL 04-W0319作用48h，將細胞阻滯在G0／G1期，并伴隨誘導凋亡而抑制細胞的生長、繁殖；但隨著作用時間的延長，04-W0319將BGC823細胞周期阻斷在G2／M期，并伴隨著細胞發(fā)生壞死。免