靶向性泛素化降解胰島素樣生長因子受體和胰島素受體的腫瘤基因治療策略.pdf

1、胰島素樣生長因子受體（Insulin-likeGrowthFactor-IReceptor,IGF-1R）是受體型酪氨酸激酶（ReceptorTyrosineKinase,RTK）家族中的成員之一，在很多腫瘤細胞中，都存在IGF-1R的過度表達。IGF-1R是由位于胞外的α亞基和位于胞內(nèi)的β亞基構(gòu)成，兩亞基以二硫鍵連接。其中α亞基負責(zé)與胞外配體結(jié)合，β亞基含有激酶催化結(jié)構(gòu)域和多個磷酸化位點。當(dāng)配體結(jié)合或因過度表達而導(dǎo)致受體活化時，β亞基

2、胞內(nèi)多個位點發(fā)生磷酸化，從而募集下游含有PTB結(jié)構(gòu)域的胰島素受體底物1/2(InsulinReceptorSubstrate1/2,IRS-1/2)等接頭分子，進而激活下游MAPK和PI-3K等信號通路，促進細胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，抑制細胞凋亡，加速腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)化。胰島素受體（InsulinReceptor,InsR）作為細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的“幫兇”，與IGF-1R具有同樣的胞內(nèi)接頭分子，介導(dǎo)相同的細胞信號通路，引起類似的細胞效應(yīng)。因此

3、，IGF-IR和InsR是抗腫瘤治療的理想靶位。
　　泛素化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程，是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)負向調(diào)節(jié)的主要方式。泛素化反應(yīng)過程是在泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)的協(xié)同作用下，使被降解的蛋白發(fā)生泛素化，進而在蛋白酶體或溶酶體中降解。其中E3是蛋白質(zhì)降解的關(guān)鍵連接蛋白，它能夠特異性識別與結(jié)合底物，并將泛素轉(zhuǎn)移至底物。本研究中利用具有泛素連接酶活性的CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域和Cbl的RING結(jié)構(gòu)域行使降

4、解功能，下調(diào)靶蛋白IGF-IR和InsR的水平，達到抑制腫瘤的目的。
　　在本研究的第一部分實驗中，我們通過重組PCR，將IRS-1蛋白中能夠與磷酸化的IGF-IR和InsR結(jié)合的PTB結(jié)構(gòu)域（PhosphotyrosineBindingdomain）的基因與CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域基因或者Cbl的RING結(jié)構(gòu)域基因進行基因融合，將融合基因插入真核表達載體pFLAG-CMV4，構(gòu)建重組泛素連接酶。在第二部分實驗中，我們檢測了重組

5、泛素連接酶在幾種腫瘤細胞系中的表達和對靶蛋白的降解作用。研究的第三部分，著重考察了重組泛素連接酶對HeLa細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　實驗一：設(shè)計引物，利用普通PCR分別擴增IRS-1的PTB結(jié)構(gòu)域基因、CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域基因和Cbl的RING結(jié)構(gòu)域基因，PTB的下游引物與U-box、RING的上游引物設(shè)計了幾個連續(xù)的反向互補序列，利用重組PCR可將PTB與U-box、PTB與RING進行基因融合，獲得的產(chǎn)物分別命名

6、為PTB-U-box和PTB-RING。將融合基因產(chǎn)物進行EcoRI、EcoRV雙酶切處理，插入真核表達載體pFLAG-CMV4。經(jīng)過酶切鑒定和測序驗證后，將重組質(zhì)粒命名為pFLAG-CMV4-PTB-U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING，以及功能結(jié)構(gòu)域缺失的pFLAG-CMV4-PTB。
　　實驗二：將構(gòu)建成功的重組泛素連接酶轉(zhuǎn)染幾種IGF-IR和InsR高表達的腫瘤細胞系，包括SK-Br-3、HepG2、HHCC

7、以及HeLa，設(shè)立pFLAG-CMV4-PTB-U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING為實驗組，功能結(jié)構(gòu)域缺失的pFLAG-CMV4-PTB和空載體pFLAG-CMV4為陰性對照，檢測重組泛素連接酶在其中的表達，以及對靶蛋白水平的下調(diào)情況，結(jié)果顯示兩種重組泛素連接酶均能促使靶蛋白發(fā)生不同程度的下調(diào)。同時設(shè)計引物，進行Real-timePCR實驗，檢測重組泛素連接酶的導(dǎo)入，對靶蛋白的mRNA水平是否造成影響，以確定靶蛋白豐度的

8、降低是在翻譯后水平產(chǎn)生的。
　　實驗三：隨后選取了降解效果最明顯的HeLa細胞進行細胞學(xué)實驗，設(shè)立pFLAG-CMV4-PTB-U-box和pFLAG-CMV4-PTB-RING為實驗組，pFLAG-CMV4-PTB、和pFLAG-CMV4為陰性對照，MTT比色實驗、平板克隆形成實驗檢測重組泛素連接酶對腫瘤細胞的增殖能力的影響，Transwell實驗檢測其對細胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，兩種重組泛素連接酶能夠明顯的抑制腫瘤細胞

9、的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲能力。
　　綜上所述，在多種腫瘤細胞中都存在RTK的異?；罨瓦^度表達，靶向降解這些分子是行之有效的抑制腫瘤的方法。IGF-1R和InsR都是RTK家族中的重要成員，參與腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)化。它們的下調(diào)能夠抑制腫瘤的發(fā)展，所以成為腫瘤治療中的理想靶位。泛素化是一種常見的翻譯后修飾方式，經(jīng)典的泛素化修飾介導(dǎo)蛋白質(zhì)的泛素-蛋白酶體降解途徑，使被修飾的底物蛋白發(fā)生降解。利用能夠特異結(jié)合IGF-1R和InsR的接頭分子的受體