c-myc小干擾RNA對(duì)HL-60細(xì)胞增殖、凋亡的影響.pdf

1、c-myc基因是調(diào)控細(xì)胞增殖與分化的癌基因，在急性白血病細(xì)胞株及急性白血病、惡性淋巴瘤患者細(xì)胞中均出現(xiàn)高表達(dá)，是影響這些惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要基因之一。多數(shù)腫瘤中c-myc基因高表達(dá)的原因被認(rèn)為是c-myc的啟動(dòng)子發(fā)生突變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變，另外一種原因可能是因?yàn)閏-myc mRNA的3'或5'端非翻譯區(qū)突變導(dǎo)致c-myc的mRNA穩(wěn)定性增高。缺乏下調(diào)c-myc表達(dá)在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演非常重要的角色。RNA干擾(RNA inte

2、rference)是許多生物體內(nèi)的一種保守機(jī)制。RNAi是指一種雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)使其沉默的過(guò)程，是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。其基本原理是dsRNA通過(guò)RNaseⅢ內(nèi)切酶Dicer的作用產(chǎn)生21～23 nt有活性的小干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)，然后在細(xì)胞內(nèi)形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA in

3、duced silence complex，RISC)，RISC根據(jù)堿基互補(bǔ)以siRNA為模板特異地識(shí)別其同源基因mRNA，并對(duì)其進(jìn)行遞進(jìn)式剪切，誘導(dǎo)序列特異性mRNA的降解，從而抑制基因表達(dá)。RNAi是新近發(fā)展起來(lái)的一種基因功能研究的新方法<'[1，2]>，因而得到迅速發(fā)展，目前已廣泛應(yīng)用于功能基因組和基因治療的研究<'[3,4]>。本研究選擇高表達(dá)c-myc的HL-60細(xì)胞株<'[5]>作為研究對(duì)象，觀察c-myc siRNA對(duì)其增

4、殖、凋亡的影響。 目的：探討c-myc小干擾RNA對(duì)急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60增殖、凋亡、基因、蛋白的影響。探尋白血病基因治療的新方法。 方法：針對(duì)c-myc mRNA的第1762-1782靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)siRNA，利用T7 RNA聚合酶和雙鏈DNA模板采取體外轉(zhuǎn)錄法合成。合成的c-myc小干擾RNA，經(jīng) Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入HL-60細(xì)胞，觀察形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用四唑鹽(MTT)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)

5、曲線，細(xì)胞集落培養(yǎng)觀察c-myc siRNA對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和DNA片段化分析細(xì)胞的調(diào)亡，RT-PCR及Westernblot檢測(cè)c-myc siRNA作用前后c-myc、hTERT基因mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化。 結(jié)果：c-myc siRNA能明顯抑制HL-60細(xì)胞增殖，半數(shù)抑制濃度IC<,50>約為150nM。(1)MTT法檢測(cè)siRNA對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，對(duì)克隆形成有明顯的抑制作用。