DADS作用HL-60細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、第一部分 DADS誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞增殖抑制和凋亡作用 目的：研究二烯丙基二硫（DADS）對(duì)人白血病細(xì)胞HL-60的增殖、凋亡及其周期分布的影響。 方法：通過(guò)繪制不同濃度DADS作用后HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間，研究DADS對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制作用，并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。采用形態(tài)學(xué)觀察、PI單染和Annexin Ⅴ/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)以及DNA瓊脂糖凝膠電泳等方法來(lái)證實(shí)細(xì)胞凋亡。

2、 結(jié)果：(1) 生長(zhǎng)曲線表明，60μmol·L-1和120μmol·L-1 DADS對(duì)HL-60細(xì)胞增殖抑制作用明顯。(2) 常規(guī)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞群體倍增時(shí)間為18.45h，60μmol·L-1和120μmol·L-1DADS作用后細(xì)胞群體倍增時(shí)間分別延長(zhǎng)至30.95h和60.70h。(3) DADS抑制HL-60細(xì)胞增殖與周期阻滯有關(guān)，15μmol·L-1和30μmol·L-1 DADS主要將HL-60細(xì)胞阻滯于S期和G2/M期，

3、60μmol·L-1和120μmol·L-1 DADS主要將HL-60細(xì)胞阻滯于G1期。(4) PI單染流式細(xì)胞術(shù)顯示，15、30、60μmol·L-1 DADS作用HL-60細(xì)胞24h后，細(xì)胞凋亡率分別為（3.45±0.35）％、（10.90±0.85）％、（33.25±1.63）％，呈濃度依賴性增加。(5) Annexin Ⅴ/PI雙染法顯示，60μmol·L-1 DADS作用4、8、12h后，細(xì)胞凋亡率分別為（4.60±0.45）

4、％、（8.51±0.45）％、（16.92±0.77）％，具有明顯的時(shí)間依賴性。(6) 60μmol·L-1 DADS作用24h后，DNA瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)特征性的階梯狀條帶，光學(xué)顯微鏡觀察到細(xì)胞體積縮小，核濃縮和凋亡小體形成等典型的形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)論： 1.DADS可明顯抑制HL-60細(xì)胞增殖，并與細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。 2.60μmol·L-1 DADS能夠有效誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。 第二部分 DA

5、DS作用HL-60細(xì)胞后相關(guān)基因表達(dá)譜分析 目的：應(yīng)用基因芯片技術(shù)獲得DADS作用HL-60細(xì)胞后相關(guān)基因的表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)基因。從基因水平探討DADS對(duì)HL-60細(xì)胞的作用機(jī)制。 方法：提取60μmol·L-1DADS作用4h后的HL-60細(xì)胞和未處理HL-60細(xì)胞中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行生物素標(biāo)記，與Superarray公司的含有288個(gè)基因的人細(xì)胞凋亡和周期基因芯片雜交，GEArray軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行

6、分析，篩選出DADS作用后差異表達(dá)顯著的基因，并采用RT-PCR和Western blot技術(shù)驗(yàn)證芯片結(jié)果可靠性。 結(jié)果：(1) 基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DADS作用后有6個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，包括：Fas-L、TRAF1、TRAF5、E2F6、IL8和CXCL10；22個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)，包括：Bag-1、BNIP3、MCL-1、TNFRSF10C、TNFRSF8、Cyclin B、Cyclin C、Cks1p9、CUL4A、E2F-

7、4、Hus1、MCM2、MKI67、MRE11B、NEDD8、PCNA、SKP1A、GPX1、CAT、DNAJA1、HSPA4和HSPA9B。(2) RT-PCR和Western blot驗(yàn)證結(jié)果表明，60μmol·L-1 DADS作用后Fas-L表達(dá)增強(qiáng)，Bag-1表達(dá)減弱，與芯片結(jié)果一致。 結(jié)論： 1.DADS可能通過(guò)下調(diào)MCM2、MKI67和PCNA抑制HL-60細(xì)胞增殖。 2.DADS可能通過(guò)下調(diào)Cycl