北美一球懸鈴木組織培養(yǎng)及利用安全篩選標(biāo)記基因進(jìn)行耐鹽轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、土壤鹽漬化是一個(gè)世界性問(wèn)題，在鹽堿地上植樹(shù)造林不僅可以改良和利用鹽堿地，而且可以帶來(lái)明顯的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益，因此，耐鹽樹(shù)種的選育是國(guó)內(nèi)外林木育種工作者關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。北美-球懸鈴木(Platanus occidentalis L.)作為一種重要的園林綠化和工業(yè)用材樹(shù)種，開(kāi)展其組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化研究是培育該樹(shù)種耐鹽新品種的有效途徑。本文選用北美-球懸鈴木為研究材料建立其體外組織培養(yǎng)再生體系，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了耐鹽Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

2、基因(AtNHX1)的遺傳轉(zhuǎn)化研究，主要結(jié)果如下： 1)利用北美-球懸鈴木葉片外植體，通過(guò)對(duì)分化、生根和移栽等體外再生過(guò)程的研究，建立了北美-球懸鈴木高效穩(wěn)定的體外再生體系。其分化培養(yǎng)基為WPM+6-BA(5.0mg1-1)+IBA(0.1mg1-1)+蔗糖(3％)，最大分化率達(dá)到90％，平均芽個(gè)數(shù)為13.72；壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA(0.3mg1-1)+NAA(0.03mg1-1)+腺嘌呤(2％)+蔗糖(3％)：生根培養(yǎng)基

3、為1/2MS+IBA(0.1mg1-1)+蔗糖(2％)。北美-球懸鈴木再生苗經(jīng)RAPD分子標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)由組織培養(yǎng)引起的多態(tài)率在0.0104％以下，表明北美-球懸鈴木體外再生植株遺傳穩(wěn)定性好。 2)利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含安全選擇標(biāo)記基因manA和耐鹽AtNHXl基因的雙T-DNA表達(dá)載體進(jìn)行了北美-球懸鈴木耐鹽基因遺傳轉(zhuǎn)化研究，通過(guò)甘露糖敏感性測(cè)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨甘露糖濃度增加，北美-球懸鈴木不定芽分化率降低，表明北美-球懸鈴木對(duì)甘露糖敏感

4、，不能直接利用甘露糖進(jìn)行代謝反應(yīng)，因此可以利用甘露糖對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行篩選；受體葉片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，在含不同濃度的甘露糖和蔗糖的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化，不定芽經(jīng)PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在含10g1-1甘露糖和15g1-1蔗糖的培養(yǎng)基上其轉(zhuǎn)化效率為12.76％，因此確定該濃度組合為北美-球懸鈴木甘露糖篩選適宜的選擇壓。 (3)以北美-球懸鈴木葉片為受體材料，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和甘露糖篩選，獲得了一批經(jīng)PCR和氯酚紅(CPR)檢測(cè)均呈