小油桐組織培養(yǎng)及ipt基因遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、小油桐屬大戟科麻瘋樹屬落葉灌木或小喬木，目前因其種子含油量較高而備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)以小油桐為研究對(duì)象，建立了高效的組織培養(yǎng)再生體系，并在此基礎(chǔ)上建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)小油桐遺傳轉(zhuǎn)化體系，優(yōu)化了遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)參數(shù)，將細(xì)胞分裂素合成限速酶--異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因(ipt)導(dǎo)入小油桐基因組中，并對(duì)轉(zhuǎn)基因小油桐植株的生理特性進(jìn)行檢測，初步篩選出抗寒性增強(qiáng)的小油桐植株。其主要研究內(nèi)容如下： 1.小油桐高效組織培養(yǎng)再生體系的建立 本研究在MS+

2、6-BA1.0mg·L-1培養(yǎng)基上培養(yǎng)小油桐無菌苗，以苗齡12d的無菌苗子葉為外植體，MS+6-BA3.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1為愈傷組織和再生芽最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)率為100％，再生芽誘導(dǎo)率為95.8％；以苗齡30d無菌苗的真葉為外植體，MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.5mg·L-1為小油桐真葉最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)率為100％，再生芽誘導(dǎo)率為85.0％；以苗齡30d的無菌苗真葉柄為外植體，M

3、S+6-BA1.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1對(duì)小油桐真葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)率為100％，再生芽誘導(dǎo)率為100％；不定芽增殖和壯苗培養(yǎng)以MS+6-BA1.0mg·L-1為最佳，不定芽增殖倍數(shù)為2.9。最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.5mg·L-1，生根率為82.4％。移栽基質(zhì)為泥土：珍珠巖=2:1中，成活率為80％。 2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)小油桐子葉遺傳轉(zhuǎn)化 以小油桐子葉為受體的根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化研究體系：確定分化

4、時(shí)Kan的有效篩選濃度為30mg·L-1，生根時(shí)Kan的有效篩選濃度為10mg·L-1；確定頭孢霉素(Cef)濃度為150mg·L-1。詳細(xì)探討了外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、浸染菌液濃度、浸染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等影響因素對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響.結(jié)果表明，以小油桐種子在MS+6-BA1.0mg·L-1萌發(fā)12d的無菌苗子葉為外植體，接入MS+6-BA3.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1中，25℃暗箱中預(yù)培養(yǎng)2d，OD600值0.6-0.8菌液浸染1

5、0min，無菌紙吸去多余菌液后接入MS+6-BA3.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1培養(yǎng)基，暗箱共培養(yǎng)3d，MS+6-BA3.0mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+Kan30mg·L-1+Cef150mg·L-1脫菌和篩選培養(yǎng)。GUS染色和PCR檢測初步證明ipt基因已整合到小油桐基因組中。 3.轉(zhuǎn)ipt基因小油桐生理生化研究 本研究將轉(zhuǎn)基因小油桐與對(duì)照于4℃處理72h，分析測定了低溫處理前后轉(zhuǎn)基因小油桐的生