轉(zhuǎn)錄因子Sox2對(duì)胃粘膜腸化生表型轉(zhuǎn)變作用的研究.pdf

1、目的： 胃粘膜腸上皮化生（Intestinal metaplasia，IM）是腸型胃癌發(fā)病機(jī)制Correa’s級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)中間步驟，一般被認(rèn)為是一種癌前病變，盡管這個(gè)問(wèn)題仍然存在爭(zhēng)議。胃粘膜IM發(fā)生的機(jī)制還沒(méi)有被詳細(xì)闡明。如果我們想要預(yù)防腫瘤從這些病變中發(fā)生，就有必要研究控制這個(gè)過(guò)程的因子。研究表明干細(xì)胞及其后代從胃表型轉(zhuǎn)變?yōu)槟c表型的過(guò)程的啟動(dòng)常常是由轉(zhuǎn)錄因子控制的。 已有一些關(guān)于胃粘膜IM中腸轉(zhuǎn)錄因子Cdx1和Cdx

2、2表達(dá)及功能方面的研究，但控制胃表型的因子還知之甚少，一個(gè)候選者就是含有Sry樣HMG盒子的轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一Sox2基因。我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明轉(zhuǎn)錄因子Cdx2和Sox2是否以及如何調(diào)控胃粘膜IM的表型轉(zhuǎn)變。 方法： 1.使用免疫組化方法檢測(cè)80例病理學(xué)診斷為胃炎、輕度IM、中度IM和重度IM的石蠟包埋胃粘膜標(biāo)本中SOX2和CDX2蛋白的表達(dá)；使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)40例病理學(xué)診斷為胃炎、輕度IM和中重度I

3、M的胃鏡活檢標(biāo)本中Sox2和Cdx2mRNA表達(dá)。 2.使用甲基化特異性PCR檢測(cè)40例病理學(xué)診斷為胃炎、輕度IM和中重度IM的內(nèi)鏡活檢胃粘膜組織的啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。 3.將pcDNA3.1/Cdx2質(zhì)粒和Sox2siRNAs分別及共同轉(zhuǎn)染到人胃上皮細(xì)胞系GES-1中分別使Cdx2上調(diào)和Sox2下調(diào)。RT-PCR檢測(cè)Muc2、Sox2和Cdx2 mRNA的表達(dá)改變。將腸杯狀細(xì)胞標(biāo)志物Muc2 mRNA的出現(xiàn)，視為完成腸

4、型轉(zhuǎn)化。 結(jié)果： 1.SOX2和CDX2蛋白分別定位于正常胃和腸上皮細(xì)胞胞核。胃炎、輕度IM組、中度IM組和重度IM組中SOX2和CDX2蛋白陽(yáng)性率分別為94.4%vs5.6%、75%vs50%、23.5%vs85.7%、9.5%vs90.5%，差異有顯著性（P<0.05）。在化生腺體中有SOX2蛋白的減少和CDX2蛋白的異位表達(dá)。 2.胃炎組、輕度IM組、中重度IM組Sox2和Cdx2mRNA水平分別為0.57

5、78±0.0778 vs0.0517±0.0218、0.1496±0.0384 vs0.1402±0.0300、0.1131±0.0384vs0.3453±0.0537，差異有顯著性（P<0.05）。隨著IM進(jìn)展，從胃炎、輕度IM到中重度IM中Sox2mRNA逐漸減少，而Cdx2逐漸被上調(diào)，二者呈逆相關(guān)（r<0）。 3.Sox2和Cdx2的啟動(dòng)子甲基化分別出現(xiàn)在33.3%和83%的胃炎，56.25%和62.5%的輕度IM，83.

6、33%和25%的中重度IM中，差異有顯著性（P<0.05）。Sox2和Cdx2 mRNA表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)逆相關(guān)（r<0）。 4.人胃上皮細(xì)胞GES-1中，pcDNA3.1/Cdx2和Sox2siRNAs分別顯著上調(diào)了Cdx2和下調(diào)了Sox2。下調(diào)Sox2可以導(dǎo)致Muc2和Cdx2表達(dá)上調(diào)；而上調(diào)Cdx2能夠上調(diào)Muc2并下調(diào)Sox2；下調(diào)Sox2和上調(diào)Cdx2聯(lián)合的作用強(qiáng)于二者各自單獨(dú)的作用。說(shuō)明腸轉(zhuǎn)錄因子Cdx2和胃

7、轉(zhuǎn)錄因子Sox2有相互負(fù)調(diào)控作用，都在胃粘膜IM的形成中起重要作用。 結(jié)論： 1.隨著胃IM的進(jìn)展，有Sox2的表達(dá)下調(diào)和Cdx2的異位表達(dá)。 2.表觀遺傳學(xué)機(jī)制，尤其是DNA甲基化可能在Sox2和Cdx2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起重要作用。 3.在胃IM進(jìn)展中，胃轉(zhuǎn)錄因子Sox2和（或）腸轉(zhuǎn)錄因子Cdx2在啟動(dòng)胃表型向腸表型轉(zhuǎn)化中都起了重要作用。 目的： 胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，雖然我國(guó)近

8、年其發(fā)病率有所下降，但其死亡率仍具各類惡性腫瘤死亡之首。從基因水平上研究胃癌發(fā)展的分子學(xué)機(jī)制可為臨床治療和預(yù)防提供理論指導(dǎo)，因而成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。我們觀察了特異的siRNAs對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞IGF-Ⅰ R基因表達(dá)的抑制作用，研究干擾下調(diào)IGF-Ⅰ R對(duì)體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法： 設(shè)計(jì)并體外合成2條靶向IGF-Ⅰ R的siRNAs，脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的MGC803細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后以W

9、estern blot法檢測(cè)細(xì)胞IGF-Ⅰ R蛋白的水平，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，細(xì)胞計(jì)數(shù)并描記生長(zhǎng)曲線，以流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡（Annexin V-FITC/PI法）。 結(jié)果： 轉(zhuǎn)染后48h，Western blot檢測(cè)顯示干擾組（siRNA2低劑量組、siRNA2高劑量組、siRNA1組）MGC803細(xì)胞IGF-Ⅰ R蛋白抑制率分別為64.41%±4.11%、74.14%±6.15%、89.8%±4.1

10、0%）；轉(zhuǎn)染后第2～5天細(xì)胞活力逐漸減少，分別達(dá)對(duì)照組的49.9%±1.2%、45.9%±4.4%、39.1%±5.1%、29%±4.0%，同期生長(zhǎng)曲線顯示細(xì)胞數(shù)分別為對(duì)照組的65.58%±4.89%、55.59%±0.82%、44.18%±3.17%、21.15%±1.1%；但FCM檢測(cè)各組細(xì)胞的早期凋亡百分比均<5%，各組之間的凋亡百分比差異未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 特異的siRNAs可顯著抑制MGC803細(xì)胞中的I