轉(zhuǎn)錄因子SOX2通過(guò)PTEN-Rb途徑抑制胃癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移.pdf

1、【背景】:
　　胃癌(GastricCarcinoma)的發(fā)病率在中國(guó)位于惡性腫瘤的第二位。迄今為止,其病因及發(fā)生的分子機(jī)制仍不清楚。SOX2作為一個(gè)控制胚胎器官發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子被廣泛研究,特別因?yàn)槟芘c其它的轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用,使體細(xì)胞逆分化為IPS細(xì)胞而變得非常著名。它除了參與干細(xì)胞全能性的維持、胚胎的發(fā)育外,在神經(jīng)系統(tǒng)、胃的器官發(fā)育、維持胃上皮細(xì)胞的表型和功能等方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明,SOX2表達(dá)下降和丟失可能與胃癌的發(fā)生

2、、發(fā)展密切相關(guān)。但由于使用檢測(cè)方法、組織來(lái)源以及研究目的不同等原因,使得既往有關(guān)SOX2在胃癌中的表達(dá)及其與胃癌臨床病理參數(shù)間關(guān)系的研究結(jié)果不太一致。因而SOX2在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的變化規(guī)律、作用機(jī)制以及與臨床預(yù)后之間的關(guān)系值得進(jìn)一步的探索與深究。
　　【目的】:
　　SOX2是胃發(fā)育特異性轉(zhuǎn)錄因子,其異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究旨在探討SOX2在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中不同病理階段的表達(dá)變化及其臨床意義,以及S

3、OX2對(duì)胃癌細(xì)胞惡性表型的影響及其分子機(jī)制。
　　【方法】:
　　1.用免疫組化方法檢測(cè)32例正常胃粘膜,162例慢性淺表性胃炎,122例慢性萎縮性胃炎(或伴腸化/低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變),378例胃腺癌,61例胃癌轉(zhuǎn)移灶中SOX2蛋白的表達(dá)水平;用WB、qRT-PCR檢測(cè)從西京消化病醫(yī)院病理科獲得的10例胃癌及癌旁組織新鮮冰凍手術(shù)切除標(biāo)本中SOX2的表達(dá);分析SOX2在胃癌進(jìn)程各病理階段組織中的表達(dá),并總結(jié)其與胃癌臨床病理參數(shù)的

4、關(guān)系;
　　2.構(gòu)建SOX2過(guò)表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體及其陰性對(duì)照載體,使SOX2過(guò)表達(dá),感染MKN28胃癌細(xì)胞。通過(guò)WST-1,裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)及Ki67免疫組化染色分別檢測(cè)SOX2在體內(nèi)與體外對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響;
　　3.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)及組織細(xì)胞凋亡小體染色檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡的變化;
　　4.通過(guò)Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)以及裸鼠尾靜脈注射內(nèi)臟轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)分別在體外和體內(nèi)研究SOX2對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響;<

5、br>　　5.通過(guò)ChIP-GLS和表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選SOX2可能作用的靶基因,并用生物信息學(xué)分析鎖定SOX2作用的靶基因,后進(jìn)一步用ChIP-PCR、EMSA、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證;
　　6.在SOX2高表達(dá)的胃癌細(xì)胞系中采用預(yù)測(cè)靶基因敲除技術(shù)建立功能缺失模型驗(yàn)證預(yù)測(cè)的靶基因是否可拮抗SOX2高表達(dá)后產(chǎn)生的惡性生物學(xué)行為;
　　7.用WB法檢測(cè)胃癌細(xì)胞中SOX2高表達(dá)前后相應(yīng)預(yù)測(cè)靶基因表達(dá)水平的變化,并用免疫

6、組化方法檢測(cè)這種表達(dá)變化關(guān)系對(duì)胃癌臨床預(yù)后判斷的重要意義。
　　【結(jié)果】:
　　1.SOX2的表達(dá)水平與胃癌發(fā)生進(jìn)程中臨床病理參數(shù)的分析結(jié)果提示,SOX2在正常胃粘膜、腸化、不典型增生、胃癌以及轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)逐漸降低。SOX2的表達(dá)降低與胃癌的分化程度、TNM分期及患者預(yù)后密切相關(guān),并可作胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　2.與對(duì)照細(xì)胞相比,在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)SOX2后,WST-1、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)及Ki67免疫組化染色結(jié)果

7、表明胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)減慢;流式細(xì)胞術(shù)及組織細(xì)胞凋亡小體染色顯示細(xì)胞凋亡增加;Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)以及裸鼠尾靜脈注射內(nèi)臟轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)均提示胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱;但細(xì)胞周期無(wú)明顯變化。
　　3.ChIP-GLS技術(shù)發(fā)現(xiàn),胃癌細(xì)胞中有718個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的啟動(dòng)子能與SOX2結(jié)合;表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,SOX2過(guò)表達(dá)后細(xì)胞差異表達(dá)的基因有320個(gè)。取兩者的交集,共有11個(gè)基因,其中2個(gè)表達(dá)上調(diào),9個(gè)表達(dá)下調(diào)。生物信息學(xué)分析表明

8、,PTEN作為表達(dá)上調(diào)的基因可能是SOX2直接調(diào)控的靶基因。
　　4.ChIP-PCR、EMSA、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)以及一系列功能學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)證實(shí),SOX2通過(guò)上調(diào)PTEN,PTEN使Rb去磷酸化來(lái)抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖,阻止胃癌細(xì)胞凋亡,并削弱其侵襲遷移能力,而對(duì)細(xì)胞周期并未產(chǎn)生影響。
　　5.用免疫組化檢測(cè)SOX2、PTEN、Rb在203例癌/癌旁配對(duì)組織中表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX2與PTEN的表達(dá)正相關(guān),與pRb的表達(dá)負(fù)相關(guān)

9、。SOX2與PTEN、Rb聯(lián)合在判斷胃癌預(yù)后中有重要臨床意義,根據(jù)SOX2、PTEN的表達(dá)情況,將胃癌患者分為SOX2(+)PTEN(+),SOX2(+)PTEN(-),SOX2(-)PTEN(+),SOX2(-)PTEN(-)四組,結(jié)果提示SOX2、PTEN表達(dá)同時(shí)降低,Rb表達(dá)升高的患者其預(yù)后更差。
　　【結(jié)論】:
　　1.SOX2在胃癌前病變中已發(fā)生顯著的表達(dá)降低,SOX2表達(dá)降低是胃癌發(fā)生過(guò)程中的早期事件。SOX2的