Sox2在乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移中的作用分析.pdf

1、目的：研究Sox2蛋白在乳腺癌ZR7530細胞株中的細胞生物學(xué)行為，并通過尋找ZR7530中與SOX2相關(guān)的miRNA，進一步探討乳腺癌惡性事件中可能涉及的分子機制。
　　方法：1、利用Western blotting從蛋白水平檢測Sox2的表達情況，以驗證所構(gòu)建的ZR7530 Sox2沉默、過量表達及對照三個穩(wěn)定細胞系；
　　2、采用細胞計數(shù)、平板克隆形成實驗觀察ZR7530細胞增殖及成瘤能力，通過損傷修復(fù)實驗檢測腫瘤細胞

2、的遷移能力；并進一步皮下接種腫瘤細胞，每三天測量一次裸鼠腫瘤體積；此外，通過尾靜脈注射腫瘤細胞，八周后處死裸鼠，取肺組織行HE染色，檢測腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力；
　　3、應(yīng)用miRNA芯片(miRCURYLNA Expression Array(v.18.0))檢測與Sox2相關(guān)的差異表達miRNA，利用SAM軟件將變化倍數(shù)Sox2-KD/Scramble或pCDH-Sox2/Scramble≤0.5或≥2的視為差異表達miRNA，對

3、篩選出的差異表達miRNAs利用數(shù)據(jù)庫TargetScan、miRDB、PicTar、miRanda分析相應(yīng)的靶基因。
　　結(jié)果：1、與對照組相比，ZR7530 Sox2-KD細胞中Sox2蛋白表達水平明顯下降(P=0.0480)，ZR7530 pCDH-Sox2的Sox2蛋白表達量顯著提高(P=0.0296)。
　　2、細胞計數(shù)實驗結(jié)果顯示：72h開始，pCDH-Sox2與S cramble相比細胞增殖能力提高，且差異具有

4、統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0106,P＜0.05）；96h時，pCDH-Sox2與Scramble相比，差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0021,P＜0.01）；而Sox2-KD增殖雖比Scramble略減，但直到96 h差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.1179，P＜0.05）。平板克隆實驗結(jié)果：計數(shù)直徑φ0.5mm的克隆結(jié)果顯示，與對照組相比，Sox2-KD組克隆數(shù)明顯減少，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0377,P＜0.05），而Sox2過量表

5、達的ZR7530細胞克隆數(shù)目雖有增加，但效果不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.4401,P＜0.05）。損傷修復(fù)實驗結(jié)果：與對照組相比較，SOX2過量表達組24h前遷移不明顯，24h后細胞遷移開始增多，48h時，與對照相比遷移能力提高（P=0.0379，P＜0.05）；SOX2沉默組細胞遷移較慢，但差異不顯著（P=0.9738，P＜0.05）。體內(nèi)成瘤實驗結(jié)果：接種ZR7530 pCDH-Sox2的裸鼠成瘤后腫瘤生長迅速（P=0.005

6、7，P＜0.01），Sox2沉默組與對照相比，腫瘤生長速度減慢（P=0.0220，P＜0.05）。腫瘤細胞裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)果：注射ZR7530 pCDH-Sox2的裸鼠肺組織鏡下可見大面積轉(zhuǎn)移灶（P=0.0055,P＜0.01），而注射ZR7530 Sox2-KD的裸鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶較少（P=0.3894,P＜0.05）。
　　3、根據(jù)miRNA芯片檢測結(jié)果，將ZR7530 Sox2-KD、ZR7530 pCDH-Sox2分別與ZR753

7、0 Scramble相比，結(jié)果Sox2-KD與Scramble比較共篩選出91種差異表達miRNAs，其中49種miRNAs表達上調(diào)，42種表達下調(diào)；此外，pCDH-Sox2與Scramble比較共篩得251個差異表達miRNAs，其中136個miRNAs表達上調(diào)，115個表達下調(diào)。
　　結(jié)論：1、驗證了前期構(gòu)建的ZR7530 Scramble、Sox2-KD及pCDH-Sox2三個細胞系；
　　2、Sox2在體外可促進乳腺