IBDV毒力分子機(jī)制研究及反向遺傳操作系統(tǒng)的建立.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectiousbursal disease virus，IBDV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病。IBDV有兩個(gè)血清型，血清Ⅰ型和血清Ⅱ型，其中Ⅰ型對(duì)雞有致病性，Ⅱ型可以感染雞和火雞，但均沒有致病性。根據(jù)抗原和毒力的差異，血清Ⅰ型毒株可以分為經(jīng)典毒株(classical strains)、變異株(variantstrains)

2、和超強(qiáng)毒株(very virulent strains，vvIBDV).
　　我國(guó)從上個(gè)世紀(jì)90年代開始出現(xiàn)vvIBDV，目前分離的野毒株也主要是vvIBDV。本研究通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)近年來(lái)分離的5株vvIBDV的VP2基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其在七肽區(qū)326-332的氨基酸均為SWSASGS，在與毒力相關(guān)的特征性氨基酸位點(diǎn):222A、253Q、256I、279D、284A、294I和299S也都沒有發(fā)生變化。通過(guò)SPF雞致病性試驗(yàn)，5個(gè)毒株引

3、起的死亡率都在47％以上，說(shuō)明vvIBDV近20年來(lái)毒力比較穩(wěn)定，沒有發(fā)生明顯變化;5個(gè)毒株中，GX與QL，HB96與HBY核苷酸同源性較高，分別達(dá)到99.8％和99.5％，說(shuō)明不同年代的分離株變異不大，同源性很高。
　　B87是當(dāng)前使用最為廣泛的疫苗株，為了比較vvIBDV與B87序列之間的差異，對(duì)B87株種毒的不同雞胚傳代毒的VP2片段進(jìn)行測(cè)序和分析，發(fā)現(xiàn)E2和E6代毒株VP2序列存在7個(gè)氨基酸的變化。將E2和E6接種CEF細(xì)

4、胞，發(fā)現(xiàn)E2不能在CEF上增殖，而E6可以產(chǎn)生明顯的CPE，說(shuō)明兩個(gè)毒株對(duì)CEF的嗜性不同。分別將E2和E6接種3周齡SPF雞，進(jìn)行毒力比較，第7天開始，E2代出現(xiàn)囊體比下降，BB指數(shù)明顯低于E6代毒株;E2代法氏囊濾泡萎縮嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)松散，E6代毒株只有部分濾泡出現(xiàn)萎縮，濾泡間隔基本正常，說(shuō)明E2，E6代毒株對(duì)SPF雞的法氏囊毒力存在明顯差異。根據(jù)IBDV相關(guān)研究結(jié)果以及兩個(gè)毒株的VP2序列差異，推測(cè)Q253H/D279N/A284T三

5、個(gè)位點(diǎn)是影響IBDV毒力和細(xì)胞嗜性的分子基礎(chǔ)。
　　為進(jìn)一步研究影響IBDV毒力和細(xì)胞嗜性分子機(jī)制，利用高保真的DNA聚合酶通過(guò)一步法擴(kuò)增獲得IBDV B87基因組A，B片段，并通過(guò)重疊PCR的方法成功在基因組兩端引入HamRz和HdvRz核酶序列，保證轉(zhuǎn)錄水平基因組的完整性，然后將帶有核酶序列的A，B片段克隆到真核表達(dá)載體pCAGGS的CMV增強(qiáng)子和雞β-actin啟動(dòng)子下游，成功構(gòu)建出含有B87完整基因組的pCAGGSA和pC