兔出血癥病毒反向遺傳研究系統(tǒng)的建立.pdf

1、應(yīng)用反向遺傳系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)RNA病毒的拯救，從而可以在DNA水平上對(duì)RNA病毒進(jìn)行遺傳操作，為深入研究RNA病毒的分子生物學(xué)及病毒與宿主的相互作用提供了強(qiáng)有力的技術(shù)工具。對(duì)RNA病毒進(jìn)行遺傳拯救或構(gòu)建感染性克隆己成為分子病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒結(jié)構(gòu)與功能深入研究的必經(jīng)之路。兔出血癥(RHD)是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的兔的一種急性、敗血性、高度致死性傳染病，是危害世界養(yǎng)兔業(yè)的嚴(yán)重傳染病之一。本研究選擇兔出血癥病毒JX/97分離株，克隆其全基

2、因組cDNA，在國(guó)內(nèi)首次嘗試構(gòu)建RHDV反向遺傳系統(tǒng)，拯救經(jīng)過(guò)分子標(biāo)記的RHDV。 1.RHDVJX/CHA/97株全長(zhǎng)cDNA分子克隆的構(gòu)建 設(shè)計(jì)并合成了覆蓋JX/CHA/97株基因組的5對(duì)引物，從人工感染RHDV致死的兔肝組織中提取病毒總RNA，采用RT-PCR方法分別擴(kuò)增各基因片段。通過(guò)沉默突變引入一分子標(biāo)記(EcoRV識(shí)別位點(diǎn))以便于將來(lái)區(qū)分自然毒株和基因工程毒。利用限制性內(nèi)切酶，分別消化各基因擴(kuò)增片段和pBlu

3、escriptⅡSK(+)(即pSK)載體，構(gòu)建JX/97株基因組的全長(zhǎng)cDNA分子克隆(pBlRHDV)。分別采用PCR法、限制性內(nèi)切酶酶切法和基因組測(cè)序法對(duì)pBIRHDV進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明已成功構(gòu)建了RHDVJX/97株的全長(zhǎng)cDNA分子克隆。它不僅含有JX/97株的全基因組序列，還含有SP6啟動(dòng)子序列、一個(gè)分子標(biāo)記(EcoRV識(shí)別位點(diǎn))和引物設(shè)計(jì)中添進(jìn)的限制性酶切位點(diǎn)。 2.RHDVJX/CHA/97株全長(zhǎng)cDNA分子克隆

4、(pBIRHDV)感染性的鑒定 用NruI將pBIRHDV線形化后，以之做模板，使用RiboMAXTMLargeScaleRNAProductionSystems-SP6聚合酶系統(tǒng)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，得到病毒RNA。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將轉(zhuǎn)錄物導(dǎo)入RK-13細(xì)胞，24h后可觀察到典型的RHDV致細(xì)胞病變效應(yīng)。分別使用RT-PCR、皮下和腹腔接種SPF健康兔以及免疫電鏡觀察等方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明拯救病毒成功，獲得了感染性cDNA分子克隆。通