水皰性口炎病毒印第安納株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立及重組病毒的構(gòu)建.pdf

1、水皰性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV)為彈狀病毒科成員，主要以節(jié)肢動(dòng)物為媒介傳播，可感染嚙齒類動(dòng)物及牛、豬、馬等多種動(dòng)物，也能感染人類，但多為良性經(jīng)過(guò)。VSV主要分為兩個(gè)血清型，代表株分別為印第安納株(Indiana)和新澤西株(NewJersey)。引起的水皰性口炎(Vesicularstomatitis，VS)是一種急性高度接觸性傳染病，本病被國(guó)際獸疫局(OIE)列為A類疾病，在我國(guó)VS為外來(lái)動(dòng)物

2、病，國(guó)家進(jìn)出境動(dòng)物檢疫對(duì)象中將VSV列為二類疫病。 VSV的基因組是一單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA，基因組含有5個(gè)功能基因，分別受控于VSV聚合酶復(fù)合物特異性識(shí)別的轉(zhuǎn)錄起始和終止序列(Gs和GE)，構(gòu)成單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄單元，在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元之間可以耐受較大外源片段的插入；VSV可以在絕大多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞上生長(zhǎng)，它增殖迅速在短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到很高滴度；VSV是一種高效的干擾素誘生劑，且本身對(duì)其高度敏感；’VSV只在胞漿內(nèi)增殖，不會(huì)整合到宿主細(xì)胞基

3、因組內(nèi)造成細(xì)胞轉(zhuǎn)化。VSV的這些特點(diǎn)使其具有巨大的優(yōu)勢(shì)和潛力作為一種活病毒載體和腫瘤治療載體。 本研究利用單股負(fù)鏈RNA反向遺傳操作技術(shù)，在VSV-Ind株的基因組內(nèi)糖蛋白基因前、后非編碼區(qū)分別引入兩個(gè)供外源基因插入的限制性酶切位點(diǎn)并且成功救獲了重組病毒rVSV。在此基礎(chǔ)上又進(jìn)一步構(gòu)建了表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白的重組VSV基因組eDNA克隆，成功救獲了重組病毒fVSV-EGFP(M/N)；通過(guò)免疫熒光、電鏡觀察、RT-PCR及生長(zhǎng)動(dòng)

4、力學(xué)研究，證實(shí)救獲病毒保持典型的VSV印第安納株特點(diǎn)。采用傳統(tǒng)的蝕斑分析方法比較分析表明，重組病毒rVSV，rVSV-EGFP(M/N)與野生型VSV-Ind的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線及最高生長(zhǎng)滴度基本一致。rVSV-EGFP(M/N)在BHK21細(xì)胞連續(xù)傳代1O次仍保持綠色熒光蛋白的穩(wěn)定表達(dá)及所有生物學(xué)特性不變。 本研究填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)此項(xiàng)研究領(lǐng)域的空白，成功建立了VSV-Ind株的反向遺傳操作系統(tǒng)，為VSV作為新型重組活病毒載體疫苗和腫瘤治