水皰性口炎病毒印第安納株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立及重組病毒的構建.pdf

1、水皰性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV)為彈狀病毒科成員，主要以節(jié)肢動物為媒介傳播，可感染嚙齒類動物及牛、豬、馬等多種動物，也能感染人類，但多為良性經過。VSV主要分為兩個血清型，代表株分別為印第安納株(Indiana)和新澤西株(NewJersey)。引起的水皰性口炎(Vesicularstomatitis，VS)是一種急性高度接觸性傳染病，本病被國際獸疫局(OIE)列為A類疾病，在我國VS為外來動物

2、病，國家進出境動物檢疫對象中將VSV列為二類疫病。 VSV的基因組是一單股負鏈不分節(jié)段RNA，基因組含有5個功能基因，分別受控于VSV聚合酶復合物特異性識別的轉錄起始和終止序列(Gs和GE)，構成單獨的轉錄單元，在兩個轉錄單元之間可以耐受較大外源片段的插入；VSV可以在絕大多數體外培養(yǎng)細胞上生長，它增殖迅速在短時間內即可達到很高滴度；VSV是一種高效的干擾素誘生劑，且本身對其高度敏感；’VSV只在胞漿內增殖，不會整合到宿主細胞基

3、因組內造成細胞轉化。VSV的這些特點使其具有巨大的優(yōu)勢和潛力作為一種活病毒載體和腫瘤治療載體。 本研究利用單股負鏈RNA反向遺傳操作技術，在VSV-Ind株的基因組內糖蛋白基因前、后非編碼區(qū)分別引入兩個供外源基因插入的限制性酶切位點并且成功救獲了重組病毒rVSV。在此基礎上又進一步構建了表達增強綠色熒光蛋白的重組VSV基因組eDNA克隆，成功救獲了重組病毒fVSV-EGFP(M/N)；通過免疫熒光、電鏡觀察、RT-PCR及生長動

4、力學研究，證實救獲病毒保持典型的VSV印第安納株特點。采用傳統(tǒng)的蝕斑分析方法比較分析表明，重組病毒rVSV，rVSV-EGFP(M/N)與野生型VSV-Ind的生長動力學曲線及最高生長滴度基本一致。rVSV-EGFP(M/N)在BHK21細胞連續(xù)傳代1O次仍保持綠色熒光蛋白的穩(wěn)定表達及所有生物學特性不變。 本研究填補了國內此項研究領域的空白，成功建立了VSV-Ind株的反向遺傳操作系統(tǒng)，為VSV作為新型重組活病毒載體疫苗和腫瘤治