貓泛白細(xì)胞減少癥病毒反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)的建立.pdf

1、貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV，F(xiàn)LPV），又稱(chēng)貓細(xì)小病毒。主要易感動(dòng)物是貓，故而又稱(chēng)為貓瘟熱病，也可感染貓以外的多種貓科動(dòng)物。由于細(xì)小病毒顆粒體積極小，最初并沒(méi)有學(xué)者報(bào)道。隨著電鏡及病毒分離技術(shù)廣泛使用，科研者在傳代細(xì)胞和腫瘤組織陸續(xù)分離到細(xì)小病毒。法國(guó)人Verge首次發(fā)現(xiàn)，1939年正式命名，1985年首次在我國(guó)自然感染病例中分離到一株貓細(xì)小病毒，從而證實(shí)貓細(xì)小病毒在我國(guó)流行。19

2、86年國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)首次報(bào)道云豹、非洲幼獅、華南虎均感染了FPV。由此證明：虎、豹、獅等多種珍稀野生動(dòng)物已經(jīng)嚴(yán)重受到貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的威脅。我國(guó)某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地2008年從猴傳染性腹瀉病料中分離到一株貓細(xì)小病毒的變異株（BJ-22株），其VP2氨基酸序列與FPV的同源性高達(dá)98.75％，與CPV的同源性為98.15%。可見(jiàn)，F(xiàn)PV宿主感染譜正在不斷擴(kuò)大，已由最初的貓科動(dòng)物擴(kuò)展至非人靈長(zhǎng)類(lèi)，對(duì)社會(huì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成巨大威脅。
　　本文首先

3、對(duì)FPV HH-1/86株細(xì)小病毒理化性質(zhì)進(jìn)行鑒定，并對(duì)其全基因組進(jìn)行測(cè)序。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建該株細(xì)小病毒感染性克隆pFPV，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入F81細(xì)胞，成功拯救獲得帶有遺傳標(biāo)記的重組病毒 rFPV。為揭示貓細(xì)小病毒高頻率跨物種傳播特征和分子機(jī)制提供反向遺傳學(xué)操作平臺(tái)；為貓細(xì)小病毒跨物種傳播預(yù)警和有效防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　該株病毒電鏡下可見(jiàn)直徑20nm左右的立體對(duì)稱(chēng)細(xì)小病毒粒子。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：該病毒在連續(xù)50℃加熱1h、pH3

4、.0作用2h和乙醚作用2h，病毒TCID50升高不到一個(gè)對(duì)數(shù)，表明病毒對(duì)熱、酸、乙醚具有一定的耐受性，pH在5.8～6.80.015M PBS均能凝集1%豬紅細(xì)胞，其中pH6.5血凝活性最佳。該病毒全基因組長(zhǎng)5123nt，C+G的含量為36.35%。3’末端反向重復(fù)序列（Inverted Terminal Repeats，ITR）形成Y型結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)126nt；5’末端ITR形成U型結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)198nt。
　　本實(shí)驗(yàn)利用overlap

5、PCR方法，以病毒基因組片段M1、M2、M3為模板，克隆基因組中間大片段M1+M2+M3，經(jīng)凝膠電泳鑒定正確。通過(guò)Infusion克隆技術(shù)將中間片段M1+M2+M3插入含3’和5’端質(zhì)粒pE中。體外定點(diǎn)突變：將2981nt由A→G，產(chǎn)生一個(gè)新酶切位點(diǎn)Xho I，構(gòu)建FPV全基因組感染性克隆pFPV。經(jīng)酶切和序列測(cè)定證明pFPV正確，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，以L(fǎng)ip3000與質(zhì)粒pFPV按7.5μL：3.5μg比例轉(zhuǎn)染F81細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72h，

6、細(xì)胞出現(xiàn)明顯拉網(wǎng)、脫落等細(xì)小病毒細(xì)胞病變，將rFPV0三凍三融后按5%同步接毒，第2代后rFPV接毒量降至1%同步接毒，連續(xù)傳代至15代，用于病毒鑒定。通過(guò)CPE鑒定、免疫熒光、生長(zhǎng)曲線(xiàn)、血凝試驗(yàn)、western blot試驗(yàn)，結(jié)果證明，rFPV與親代毒（FPV HH-1/86）病毒學(xué)及生物學(xué)特性沒(méi)有明顯差異。
　　本研究為探究貓細(xì)小病毒跨物種傳播關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)、揭示貓細(xì)小病毒高頻率跨物種傳播分子機(jī)理，從而有效防治貓細(xì)小病毒跨物種