抗癲癇藥物對癲癇幼鼠認知的影響及其機制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 癲癇是臨床常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以生后第一年發(fā)病率最高，部分患兒還伴有認知功能的損害，不僅危害了身心健康，還降低了整個家庭的生活質(zhì)量。與癲癇相關(guān)的認知障礙一直是醫(yī)生及家長非常關(guān)注的問題。癲癇患兒伴發(fā)的認知障礙與發(fā)病原因、起病年齡、病灶部位、發(fā)作類型、持續(xù)時間、發(fā)作頻率及抗癲癇藥物等多種因素均有關(guān)，但由于抗癲癇藥物是可觸及、可選擇因素，且為目前治療癲癇最主要方法而受到更多的關(guān)注。傳統(tǒng)抗癲癇藥物對認知功能的影響已

2、有大量研究報道，發(fā)現(xiàn)對認知的多個方面包括空間學(xué)習(xí)記憶，運動水平，注意力甚至情緒等均可產(chǎn)生不良影響。雖然有一些研究顯示新型抗癲癇藥物較傳統(tǒng)抗癲癇藥物對認知功能的影響小，但研究并不充分，對發(fā)育期大腦影響的報道較少見，對托吡酯等藥物到底是利是弊也存有爭議。因此本研究中的抗癲癇藥物既有存在爭論的托吡酯(TPM)，也有近年臨床普遍應(yīng)用的其它新型抗癲癇藥左乙拉西坦(LEV)、拉莫三嗪(LTG)和奧卡西平(OXC)，還包括目前仍廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)抗癲癇藥

3、丙戊酸鈉(VPA)，通過不同的測試方法評價這些藥物對幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶、工作記憶及活動水平的影響。
　　 抗癲癇藥物對認知影響的具體機制至今尚不明了，使得臨床上醫(yī)生對于防治抗癲癇藥物對認知的副作用無的放矢。以往已經(jīng)進行了一些關(guān)于抗癲癇藥物對大腦功能損害的研究，大多局限于對大腦細胞凋亡的影響，但是對其他可能的機制如對神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)、神經(jīng)元前體細胞增殖和遷移影響的研究很少，對突觸結(jié)構(gòu)及功能可塑性等方面的研究更是罕見，而這些也有可能是造成

4、生前或生后接觸抗癲癇藥引起認知損害的重要原因，有必要對這些機制進行進一步的研究。
　　 目前的癲癇動物實驗多使大鼠經(jīng)歷單次癇性發(fā)作持續(xù)狀態(tài)，而臨床上的癲癇患兒常有反復(fù)發(fā)作而非單次的長時程驚厥。數(shù)項研究也顯示在未成熟動物中，單次的長時發(fā)作極少導(dǎo)致細胞喪失及發(fā)芽，也極少有學(xué)習(xí)記憶及行為缺陷，因此本實驗以經(jīng)歷3次匹羅卡品誘發(fā)癲癇發(fā)作的新生期幼鼠為模型，并與正常大鼠進行對照研究，在模擬臨床的同時觀察抗癲癇藥物是否對正常大鼠和癲癇大鼠有不

5、同的影響。此前的實驗多集中于成年期，對于發(fā)育期大腦的研究并不多，而小兒尤其是新生兒的神經(jīng)生理及解剖與成人有很大不同，如突觸產(chǎn)生及發(fā)育尚未完成，未成熟海馬和皮層神經(jīng)元對驚厥活動更易感，電驚厥傳播異常，黑質(zhì)驚厥抑制系統(tǒng)發(fā)育不足等，從而推測發(fā)育期的腦對抗癲癇藥物的反應(yīng)可能與成年期不同，之前也有研究顯示抗癲癇藥物對幼年動物認知功能的損傷大于成年動物。因此非常有必要深入研究長期應(yīng)用抗癲癇藥對發(fā)育期大腦認知功能的影響及其機制，對臨床藥物選擇提供理論

6、依據(jù)，實現(xiàn)有效控制癲癇發(fā)作同時降低對認知的影響。
　　 目的：
　　 研究長期應(yīng)用抗癲癇藥物對癲癇幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶、工作記憶、活動水平以及神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)、神經(jīng)發(fā)生、苔蘚纖維發(fā)芽、突觸可塑性相關(guān)蛋白的影響，探討抗癲癇藥物對發(fā)育期大腦認知功能的影響及其機制。
　　 方法：
　　 1.造模、分組及投藥:
　　 選用出生后1d(P1)的雄性Wistar大鼠，隨機分為癲癇組及對照組，癲癇組大鼠分別在生后1d

7、，4d及7d予腹腔注射匹羅卡品誘發(fā)癲癇發(fā)作。對照組大鼠腹腔注射同等量生理鹽水。將生后8d的存活的癲癇組大鼠隨機分為生理鹽水對照組(EP+NS)、VPA治療組(EP+VPA)、LEV治療組(EP+LEV)、OXC治療組(EP+OXC)、TPM治療組(EP+TPM)、LTG治療組(EP+LTG);對照組大鼠隨機分為生理鹽水對照組(CON+NS)、應(yīng)用VPA組(CON+VPA)、應(yīng)用LEV組(CON+LEV)、應(yīng)用OXC組(CON+OXC)、

8、應(yīng)用TPM組(CON+TPM)、應(yīng)用LTG組(CON+LTG)。自生后8d，各藥物干預(yù)組大鼠分別接受以下藥物每日灌胃1次:VPA200mg/kg、LEV100mg/kg、TPM40mg/kg、OXC100mg/kg、LTG40mg/kg。生理鹽水對照組每日接受生理鹽水灌胃。連續(xù)用藥3周。
　　 2.研究長期應(yīng)用抗癲癇藥物對幼鼠認知的影響:
　　 所有大鼠于P29-P30進行曠場測試以評價其活動水平，P31-P36時進行M

9、orris水迷宮測試評價其視覺—空間學(xué)習(xí)和記憶能力，P37P-38進行改良的Y迷宮以評價其工作記憶。
　　 3.研究長期應(yīng)用抗癲癇藥物對發(fā)育期大腦神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)、神經(jīng)發(fā)生、苔蘚纖維發(fā)芽及突觸可塑性相關(guān)蛋白的影響:
　　 用藥3周后，每組大鼠取6只斷頭取腦，測量腦重，用實時定量PCR檢測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和突觸小體相關(guān)蛋白（SNAP-25）mRNA的表達，Westernblot檢測BDNF、SNAP-25蛋白的表

10、達。每組剩余的大鼠過量麻醉后分別灌注固定取腦行BrdU染色與Timm染色觀察海馬神經(jīng)發(fā)生與苔蘚纖維發(fā)芽。
　　 結(jié)果：
　　 1.長期應(yīng)用抗癲癇藥物對幼鼠認知的影響:
　　 (1)體重增長:VPA處理組大鼠用藥4天后出現(xiàn)體重增長加快(P＜0.05)，LTG處理大鼠用藥1周后體重增張減慢(P＜0.05)。TPM、LEV及OXC處理組大鼠體重增長與相應(yīng)對照組無差異（P＞0.05）。
　　 (2)曠場實驗:EP

11、+NS組大鼠在固定時間內(nèi)穿越的方格數(shù)明顯低于CON+NS組大鼠（P＜0.01）。LEV處理組大鼠穿越的方格數(shù)較相應(yīng)對照組增多（P＜0.05)。LTG處理組大鼠穿越的方格數(shù)較相應(yīng)對照組減少（P＜0.05)。VPA、TPM及OXC處理大鼠穿越的方格數(shù)與相應(yīng)鹽水對照組無差異（P＞0.05）。
　　 (3)Morris水迷宮:EP+NS組大鼠較CON+NS組找到水下平臺的時間明顯延長，穿越原平臺位置次數(shù)減少，在目的象限停留時間縮短（P＜

12、0.05)。VPA處理組及CON+TPM組大鼠也較各自對照組找到平臺的時間延長，穿越原平臺位置的次數(shù)減少，在目的象限停留時間縮短(P＜0.05);EP+LEV組大鼠搜尋平臺的潛伏期縮短，穿越原平臺位置的次數(shù)增加，在目的象限停留時間延長(P＜0.05)。其余各組大鼠的成績與相應(yīng)對照組無差異(P＞0.05)
　　 (4)改良的Y迷宮:EP+NS組大鼠每天第一輪與第二輪測試中，每輪的后10次嘗試，與前10次相比，錯誤次數(shù)無明顯變化（P

13、＞0.05），無論是訓(xùn)練階段還是保持階段，總錯誤次數(shù)均高于CON+NS組大鼠(P＜0.05)。EP+LEV組大鼠成績優(yōu)于EP+NS組，每日兩輪測試中，每輪的后10次嘗試與前10次相比錯誤次數(shù)明顯減少(P＜0.05)。CON+TPM組大鼠的成績落后于CON+NS組，每日每輪測試后10次嘗試中的錯誤次數(shù)與前10次相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。其余各組大鼠的表現(xiàn)與相應(yīng)對照無明顯差異(P＞0.05)。
　　 2.長期應(yīng)用抗癲癇藥對B

14、DNF、神經(jīng)發(fā)生、苔蘚纖維發(fā)芽及SNAP-25的影響。
　　 (1)腦重:EP+NS組大鼠腦重較CON+NS組降低約15％(P＜0.01)。VPA及TPM處理組大鼠腦重均較相應(yīng)對照組降低（P＜0.05）。EP+LEV組大鼠腦重較EP+NS組增加(P＜0.01)。OXC、LTG處理組及CON+LEV組大鼠腦重與相應(yīng)對照組無差異（P＞0.05）。
　　 (2)BDNF:EP+NS組大鼠海馬中BDNFmRNA及蛋白表達均高于C

15、ON+NS組(P＜0.01)。VPA及TPM處理組大鼠海馬中BDNFmRNA與蛋白的表達均較相應(yīng)對照組降低（P＜0.05）。LEV及LTG處理組大鼠海馬中BDNFmRNA與蛋白的表達較相應(yīng)對照組增加(P＜0.05)。OXC處理組大鼠的表達與相應(yīng)對照組無差異(P＞0.05)。
　　 (3)神經(jīng)發(fā)生:EP+NS組大鼠海馬齒狀回、CA3區(qū)、門區(qū)和海馬外區(qū)域中BrdU標記的細胞數(shù)較CON+NS組顯著增加（P＜0.01)。EP+LEV組、

16、EP+TPM組、EP+OXC組、EP+LTG組大鼠齒狀回BrdU陽性細胞數(shù)均少于EP+NS組(P＜0.05);EP+VPA組大鼠齒狀回BrdU陽性細胞數(shù)則較EP+NS組增多(P＜0.05)。對照組中所有用藥組大鼠BrdU陽性細胞數(shù)與CON+NS組相比均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 (4)苔蘚纖維發(fā)芽:Timm染色結(jié)果顯示EP+NS組大鼠海馬CA3區(qū)及顆粒上層的Timm記分均高于CON+NS組(P＜0.05)。但所有藥物處

17、理組大鼠CA3區(qū)及顆粒上層的Timm記分與相應(yīng)生理鹽水對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (5)SNAP-25:EP+NS組大鼠海馬中SNAP-25mRNA及蛋白的表達低于CON+NS組(P＜0.01)。VPA處理組大鼠SNAP-25mRNA及蛋白的表達也較相應(yīng)對照組降低(P＜0.05)。LEV、TPM、OXC及LTG處理組與相應(yīng)對照組的NAP-25mRNA及蛋白表達無差異。(P＞0.05）
　　 結(jié)論：<

18、br>　　 1.不同的抗癲癇藥物對認知的影響不同
　　 (1)VPA損害了癲癇幼鼠及正常幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，但對工作記憶及活動水平無不良影響;VPA還可使體重增長加快。
　　 (2)LEV改善了癲癇幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶及工作記憶，但對正常幼鼠的認知無影響;LEV還增加了癲癇幼鼠及正常幼鼠活動水平，但對體重增長無影響。
　　 (3)TPM對正常幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力及工作記憶有不良影響，但未加重癲癇幼鼠的認知損

19、害，且不影響發(fā)育期幼鼠的活動水平及體重增長。
　　 (4)LTG對癲癇幼鼠及正常幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶、工作記憶無不良影響、但可致體重增長減慢及活動水平降低。
　　 (5)OXC對癲癇幼鼠及正常幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶、工作記憶、活動水平及體重增長均無不良影響。
　　 2.不同抗癲癇藥物對認知影響的機制不同。
　　 (1)VPA可致癲癇幼鼠及正常幼鼠的腦重降低，海馬中BDNF及SNAP-25的表達減少，只增強癲癇幼

20、鼠的神經(jīng)發(fā)生，不影響正常幼鼠的神經(jīng)發(fā)生及所有大鼠的苔蘚纖維。
　　 (2)LEV可致癲癇大鼠及正常大鼠海馬中BDNF表達均增高，只使癲癇幼鼠腦重增加及神經(jīng)發(fā)生降低，不影響正常大鼠的腦重、神經(jīng)發(fā)生、以及所有大鼠的苔蘚纖維和海馬中SNAP-25的表達。
　　 (3)TPM可使癲癇幼鼠及正常幼鼠的腦重降低，海馬中BDNF的表達減少，只減少癲癇幼鼠神經(jīng)發(fā)生，對正常幼鼠的神經(jīng)發(fā)生及所有大鼠的苔蘚纖維及SNAP-25的表達無影響。<