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文檔簡介
1、目的:肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一,尤其在亞洲和非洲發(fā)病率極高。僅在我國每年新發(fā)病例數(shù)就超過50萬,年死亡率約20萬例次。由于本病早期診斷不易,缺乏有效治療手段,肝癌一旦臨床確診,預(yù)后極差。所以,加強(qiáng)對肝細(xì)胞癌的病因、發(fā)病機(jī)理和早期預(yù)防研究顯得極為迫切。目前國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為肝細(xì)胞癌與乙型或丙型肝炎病毒感染、黃曲酶毒素、飲水污染、酗酒等因素有關(guān)。尤其是慢性乙型肝炎病毒(He
2、patitisBVirus,HBV)感染與肝細(xì)胞癌的發(fā)生有著密切聯(lián)系。有資料顯示,乙型肝炎病毒表面抗原(HepatitisBvirussurfaceantigen,HBsAg)攜帶者患肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)性比HBsAg陰性者高217倍。而在肝細(xì)胞癌患者中,乙型肝炎病毒感染率達(dá)到60%~90%。在肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒基因的整合也支持HBV感染是HCC的重要病因。HBV感染致HCC的確切機(jī)制尚未徹底闡明,乙肝病毒DNA的整合、HBVX基因編
3、碼產(chǎn)物反式激活作用、癌基因激活或抑癌基因失活、感染肝細(xì)胞免疫損傷及再生肝細(xì)胞累積基因突變等是目前公認(rèn)的HCC幾大發(fā)病機(jī)制。在以上過程中,多數(shù)伴有乙肝病毒基因組變異。由于HBV復(fù)制過程中容易發(fā)生堿基錯(cuò)配,而DNA聚合酶缺乏校正功能,常常發(fā)生基因突變。乙型肝炎病毒基因組某些位點(diǎn)變異可影響HBV的生物學(xué)性狀、甚至影響其致病性,而且與乙型肝炎病毒感染者的臨床進(jìn)程和預(yù)后密切相關(guān)。已有學(xué)者對肝癌患者體內(nèi)HBV基因序列研究發(fā)現(xiàn)存在較多變異,如在HCC
4、中整合的HBVDNA中前S2/S區(qū)3'端有截?cái)?,其序列編碼產(chǎn)物第79個(gè)氨基酸殘基以下的202個(gè)氨基酸殘基缺失,該產(chǎn)物具有反式激活功能,可以激活人c-myc癌基因;前S刪除突變可導(dǎo)致HBsAg在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積聚,引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和肝細(xì)胞氧化性DNA損傷、突變,從而誘導(dǎo)HCC發(fā)生。又如在肝癌患者中存在高比例的核心啟動(dòng)子區(qū)1762A→T和1764G→A錯(cuò)義突變;還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)編碼HBx第87,88,116,118,119,127和144位氨基酸編碼區(qū)變
5、異在肝癌患者中相當(dāng)頻繁。此外,在肝細(xì)胞癌中也發(fā)現(xiàn)前C/C基因區(qū)變異,但與其它慢性肝病比較無差異性,提示該區(qū)變異與HCC發(fā)生可能沒有直接關(guān)聯(lián)。P基因區(qū)是HBV基因組中最大的開放讀碼框,與多個(gè)基因相重疊,該區(qū)的變異發(fā)生也較高,但該區(qū)變異一般影響病毒的復(fù)制及前基因組RNA的包裝,與肝癌發(fā)生的關(guān)系不大??梢娨倚透窝撞《綳基因及前S/S基因變異與肝癌發(fā)生的關(guān)系更為密切。但HBV基因變異與肝癌發(fā)生之間是否存在相關(guān)還有待證實(shí)。為了找出與肝癌發(fā)病相關(guān)的
6、特征性變異位點(diǎn),以便為以后HBV相關(guān)肝癌防治研究提供理論依據(jù),我們使用高保真DNA聚合酶,對肝癌伴HBV感染患者及其家族中HBsAg陽性者血清乙型肝炎病毒X和前S/S基因片段作聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction,PCR)擴(kuò)增,分別將PCR產(chǎn)物克隆并測序。根據(jù)S基因區(qū)編碼氨基酸的差異,確定每株HBV基因型和血清型。通過BLAST檢索及與GeneBankHBV標(biāo)準(zhǔn)序列對比分析,找出HBV相關(guān)肝癌患者與非肝癌HBsA
7、g陽性者體內(nèi)乙型肝炎病毒基因變異差別。然后對兩組資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 方法:實(shí)驗(yàn)分組:肝癌組9例,均為HBsAg陽性并經(jīng)病理檢查證實(shí)的HCC患者;對照組11例,為肝癌組患者家族中HBsAg陽性者。HBsAg檢測使用酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)測定。留置血清標(biāo)本,酚氯仿法提取血清HBVDNA,根據(jù)GeneBank中HBV中國株的相應(yīng)保守序列設(shè)計(jì)引物。PCR擴(kuò)增乙型肝炎病
8、毒X基因及前S/S基因片斷,利用膠回收方法純化相應(yīng)目的基因片段,回收產(chǎn)物經(jīng)加A反應(yīng)處理后分別與pBS-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞,在含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的LB固體瓊脂平板上過夜培養(yǎng)。通過藍(lán)白斑篩選陽性克隆。細(xì)菌增殖后抽提質(zhì)粒作限制性核酸內(nèi)切酶切開,檢測切下條帶大小是否與目的基因一致,以初步判定重組質(zhì)粒有無相應(yīng)基因片段,再將重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增相應(yīng)目的基因片段鑒定。將帶有目的基因片斷的重組質(zhì)粒測序。測序引物為
9、T3或T7通用測序引物。分別將各序列結(jié)果登陸GeneBank并與標(biāo)準(zhǔn)HBV株對比,作基因分型及血清型鑒定。然后將各序列分別與相同基因型的標(biāo)準(zhǔn)株序列作BLAST檢索對比,列出每株變異位點(diǎn)。同一變異位點(diǎn)超過2株視為活躍變異位點(diǎn)。最后,將兩組資料比較,作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,找出肝癌患者體內(nèi)乙型肝炎病毒基因變異特點(diǎn),得出結(jié)論。 結(jié)果:除B2樣本未能擴(kuò)增出HBV前S/S基因,僅擴(kuò)增出S基因外,其余19個(gè)樣本均擴(kuò)增出HBVX和前S/S基因。所有HB
10、V株均屬于C或B基因型,其血清型均為adrq+或adw2。肝癌患者來源的HBV在HBx蛋白和表面抗原的B/T細(xì)胞表位、HBx蛋白的反式激活區(qū)、核心啟動(dòng)子區(qū)(Basalcorepromoter,BCP)發(fā)生的變異率較高。HBVX基因區(qū)發(fā)生錯(cuò)義突變致編碼HBx蛋白氨基酸變異有:26R→C,30V→F,33P→S,36P/A→T,38P→S,這些氨基酸位于HBx蛋白的B細(xì)胞表位;103位T→M,116V→L,118T→K,119E→D,這些氨
11、基酸位于HBx蛋白的Th細(xì)胞表位。在HBx反式激活區(qū),發(fā)現(xiàn)密碼子127V→I、129F→L變異。BCP區(qū)以1752G→A、1760T→A變異多見,但這些位點(diǎn)變異與對照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。前S/S基因變異見于前S1區(qū)84、94位氨基酸變異;前S2起始密碼子變異致M蛋白不能表達(dá);前S2區(qū)2、6、22位氨基酸發(fā)生變異;S區(qū)變異見于HBsAg抗體結(jié)合域內(nèi)129位氨基酸H→Q變異,這些位點(diǎn)變異與對照組相比也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。值得注
12、意的是,前S區(qū)刪除變異在肝癌組中比例達(dá)到44.44%(4/9),與對照組(0/10)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論:中國HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者感染的乙型肝炎病毒主要為B或C基因型,這與乙型肝炎病毒不同基因型的地理分布一致。在肝癌組中,兩型所占比例無顯著差異。HBVX和前S/S基因某些位點(diǎn)突變在肝癌組中比例較高,變異位點(diǎn)多在包膜蛋白和HBx蛋白的抗體結(jié)合域或T/B細(xì)胞表位,以及X基因的反式激活區(qū)和核心啟動(dòng)子區(qū),但這些位
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