慢性乙型肝炎患者肝細(xì)胞中調(diào)控HBV復(fù)制基因的篩選及作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分慢性乙型肝炎患者宿主肝細(xì)胞中調(diào)控HBV復(fù)制基因的篩選。方法：入選慢性HBV感染患者83例，其中免疫耐受期22例、免疫清除期(HBeAg陽性慢性乙型肝炎)25例、免疫激活期(HBeAg陰性慢性乙型肝炎)25例、非活動免疫控制期11例，并入選6例健康受試者；慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會及肝病學(xué)分會2005年制定的《慢性乙型肝炎防治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮肝穿刺活檢術(shù)獲取肝組織，采用Affymetrix R

2、NA芯片，分析不同臨床階段慢性HBV感染患者肝組織的基因表達(dá)譜；為了降低免疫因素的影響，我們主要觀察免疫耐受期和免疫控制期的不同慢性HBV感染狀態(tài)下肝組織基因表達(dá)差異。結(jié)果：與免疫耐受期患者比較，非活動免疫控制期患者肝組織有109個基因的表達(dá)存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)，其中54個基因的表達(dá)明顯上調(diào)，55個基因的表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論：慢性HBV感染各臨床階段肝組織基因表達(dá)存在差異性。其中，非活動免疫控制期與免疫耐受期相比，有109個

3、基因的表達(dá)存在顯著差異。
　　 第二部分在不同肝癌細(xì)胞系體外模型中利用小RNA干擾技術(shù)沉默特異性基因的表達(dá)，用southern blot和ELISA驗(yàn)證差異基因沉默后對HBV復(fù)制的影響。方法：在穩(wěn)定表達(dá)HBV的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15中，分別轉(zhuǎn)染針對109個基因的特異性小干擾RNA后，用Southern blot檢測胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體、CMIA法檢測上清液中HBsAg及HBeAg抗原分泌的水平；同時將具有復(fù)制能力的HBV

4、感染性克隆和siRNA瞬時共轉(zhuǎn)染Huh7肝癌細(xì)胞系，同法觀察這些基因在瞬轉(zhuǎn)模型中對HBV復(fù)制的調(diào)控作用。結(jié)果：沉默部分差異基因的表達(dá)后，HepG2.2.15或Huh7瞬轉(zhuǎn)模型中HBV的復(fù)制水平出現(xiàn)明顯上調(diào)或下調(diào)。結(jié)論：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬轉(zhuǎn)HBV感染細(xì)胞模型證實(shí)前述差異表達(dá)基因可影響HBV復(fù)制，其中大部分宿主肝細(xì)胞基因與HBV復(fù)制的關(guān)系乃首次發(fā)現(xiàn)。
　　 第三部分進(jìn)一步在體外驗(yàn)證前述研究發(fā)現(xiàn)的對HBV復(fù)制影響顯著的4個代表性基因(FAM

5、176A，HIGD1A，MARVELD3和TOMM34)對HBV復(fù)制的調(diào)控效應(yīng)和可能機(jī)制。方法：分析慢性HBV患者肝組織內(nèi)FAM176A，HIGD1A，MARVELD3和TOMM34的表達(dá)水平與患者血清中HBV DNA載量的相關(guān)性；在穩(wěn)定表達(dá)HBV的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15中轉(zhuǎn)染不同濃度梯度的小干擾RNA后，用Southern blot檢測HBV復(fù)制中間體水平、CMIA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg和HBeAg，用Western b

6、lot檢測胞內(nèi)核心抗原的水平和核衣殼形成的變化以了解是否在轉(zhuǎn)錄后水平影響HBV的復(fù)制。在Huh7細(xì)胞系中共轉(zhuǎn)染FAM176A，HIGD1A，MARVELD3和TOMM34表達(dá)質(zhì)粒和可復(fù)制的HBV克隆，同樣應(yīng)用上述方法檢測過表達(dá)該基因后對HBV的復(fù)制以及病毒蛋白表達(dá)的影響。觀察過表達(dá)質(zhì)粒和HBV克隆共轉(zhuǎn)染后對HBV復(fù)制影響的劑量依耐性。luciferase熒光素酶活性檢測來觀察4個基因和HBV的啟動子的直接相互作用。結(jié)果：FAM176A，

7、HIGD1A和TOMM34的肝內(nèi)表達(dá)水平與病人血清中HBV DNA水平呈負(fù)相關(guān)，而MARVELD3的肝內(nèi)表達(dá)與患者血清中HBV DNA水平呈正相關(guān)。在HepG2.2.15細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染針對FAM176A，HIGD1A，MARVELD3和TOMM34的特異性siRNA可以促進(jìn)HBV的復(fù)制和抗原HBsAg及HBeAg的表達(dá)；而在Huh7瞬轉(zhuǎn)模型中過表達(dá)這些基因可明顯抑制HBV復(fù)制，并呈明顯的劑量依賴性；沉默MARVELD3的表達(dá)能促進(jìn)HBV核