HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌外周血單個(gè)核細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組分析.pdf

1、目的：利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法建立分辨率高和重復(fù)性好的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)相關(guān)性肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)、HBV相關(guān)性肝硬化(liver cirrhosis，LC)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)及健康對照外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)的雙向凝膠電泳(two-dim

2、ensional gel electrophoresis，2-DE)圖譜，識別鑒定其差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。為了驗(yàn)證比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果，對部分差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡(Western blot)驗(yàn)證分析，并采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測部分差異表達(dá)的蛋白質(zhì)在肝組織中的表達(dá)狀況。尋找HBV相關(guān)性HCC早期診斷、癌變機(jī)制、治療及預(yù)后監(jiān)測的外周血特異性分子標(biāo)志物。 方法： (1)采用密度梯度離心法分離HBV相關(guān)性HCC、LC、CH

3、B及健康對照靜脈血PBMC，用改良細(xì)胞裂解液裂解PBMC，抽取其總蛋白并利用蛋白質(zhì)組學(xué)專用2-DE蛋白檢測試劑盒測定總蛋白含量。 (2)利用固相pH梯度雙向凝膠電泳分離HBV相關(guān)性HCC(n=18)、LC(n=13)、CHB(n=12)及健康對照(n=10)PBMC的總蛋白質(zhì)，先將固相化pH3-10NL梯度(immobilized pH gradient，IPG)干膠條進(jìn)行第一向固相pH梯度等電聚焦(isoelectric fo

4、cusing，IEF)，取出IPG干膠條經(jīng)平衡30min后進(jìn)行第二向垂直十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)，然后對2-DE凝膠進(jìn)行藍(lán)銀染色并用LabScan掃描凝膠成像，接著采用PDQuest圖像分析軟件對2-DE凝膠圖譜依次進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測、背景消減、標(biāo)準(zhǔn)化、匹配、建立平均凝膠(matchset gel

5、)、比較差異等分析并識別差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。選取部分差異表達(dá)的蛋白質(zhì)應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption /ionization time of flight massspectrometry，MALDI-TOF-MS)檢測得到相應(yīng)的肽質(zhì)指紋圖譜，最后搜索數(shù)據(jù)庫鑒定差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。 (3)對部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)采用Western blot進(jìn)行驗(yàn)證分析。 (4)利用

6、免疫組織化學(xué)技術(shù)對HBV相關(guān)性HCC、LC、CHB病人肝組織及對照肝組織分析部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)在肝組織中的表達(dá)水平。 結(jié)果： (1)檢測PBMC總蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.0032X+0.37，R<'2>=0.998。 (2)得到了分辨率較高、重復(fù)性較好的HBV相關(guān)性HCC、LC、CHB及健康對照PBMC雙向凝膠電泳圖譜。HBV相關(guān)性HCC、LC、CHB及健康對照PBMC凝膠的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為1189±4

7、5、1016±41、1096±42及1123±39；組內(nèi)的平均匹配率分別為91.6％、90.2％、90.7％及92.8％；同一組內(nèi)3塊膠在第一向IEF方向上位置的偏差較小，分別為1.21±0.14mm、1.06±0.12mm、1.09±0.15mm及0.99±0.12mm，在第二向SDS-PAGE方向上位置的偏差也較小，分別為2.22±0.26mm、2.15±0.2mm、1.93±0.20mm及1.98±0.24mm。 (3)H

8、BV相關(guān)性HCC對比LC、CHB及健康對照PBMC凝膠的差異蛋白點(diǎn)，表達(dá)增強(qiáng)的個(gè)數(shù)分別是72±7、63±6及65±5，表達(dá)量降低的個(gè)數(shù)分別是34±5、24±4及27±4；隨機(jī)選取至少在50％的凝膠中均有相同變化及表達(dá)量相差3倍以上的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)共28個(gè)，對其進(jìn)行質(zhì)譜分析，鑒定出19個(gè)蛋白質(zhì)，在HBV相關(guān)性HCC病人PBMC中表達(dá)明顯增強(qiáng)的有熱休克蛋白質(zhì)(heat shock protein，HSP)27、ras癌基因家族(RAB14)、

9、肌動蛋白、α<,1>-抗胰蛋白及RNA結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)亞基等15個(gè)蛋白點(diǎn)；而PDX2、PDX6、HSPA8及錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)在HCC病人PBMC中低表達(dá)。這些差異蛋白質(zhì)點(diǎn)主要為蛋白質(zhì)合成與分解、分子伴侶、解毒和DAN修復(fù)相關(guān)蛋白質(zhì)、三大代謝相關(guān)酶類、細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)以及信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)等六類。 (4)Western blot對差異表達(dá)蛋白質(zhì)MnSOD及H

10、SP27半定量分析結(jié)果與比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果一致。HBV相關(guān)性HCC與LC、CHB、健康對照及胃癌病人比較，PBMC中HSP27表達(dá)明顯增高(P<0.01)，MnSOD表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。 (5)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與對照肝組織相比，HSP27在HBV相關(guān)性HCC肝組織癌細(xì)胞中表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)；LC(P=0.15)及CHB(P=0.69)肝組織中HSP27的表達(dá)均很低，與對照肝組織相比均無明顯差異。

11、 結(jié)論： (1)成功地建立用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析PBMC的實(shí)驗(yàn)方法。 (2)建立了分辨率高且重復(fù)性較好的HBV相關(guān)性：HCC、LC、CHB及健康對照PBMC雙向凝膠電泳圖譜。 (3)鑒定出差異表達(dá)蛋白質(zhì)19個(gè)，表達(dá)明顯增強(qiáng)有15個(gè)，明顯下降的有4個(gè)，其中某些可能成為HBV相關(guān)性：HCC早期診斷、癌變機(jī)制、治療及預(yù)后監(jiān)測的外周血特異性分子標(biāo)志物。 (4)HSP27在HBV相關(guān)性HCC、LC、CHB及健康