外源性microRNA阻斷HBV和HBV復(fù)制相關(guān)的宿主基因表達(dá)對HBV復(fù)制水平的影響.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球重要的公共衛(wèi)生問題。目前全球慢性HBV感染人數(shù)己超過3.5億，是導(dǎo)致肝硬化、重型肝炎及肝細(xì)胞癌(HCC)的主要原因。在中國，有大約10％的人口存在慢性HBV感染，直到目前，尚無有效的藥物能完全達(dá)到理想的抗病毒效果或者清除病毒。因此，尋找一種新的治療策略治療慢性HBV感染是必要而且緊迫的。 RNA干擾(RNAi)是一項(xiàng)新興的基因沉默技術(shù)，主要通過siRNA和microRNA(miRNA)兩種小RNA

2、分子來發(fā)揮作用。大量研究表明，通過借助于miRNA表達(dá)框架，可以實(shí)現(xiàn)將靶向特定基因的外源性人工合成的miRNA(artifieial microRNA，amiRNA)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到抑制靶基因的效果。因此，本實(shí)驗(yàn)研究分別構(gòu)建了靶向HBV不同位點(diǎn)和靶向La蛋白基因和ASGPR1基因等宿主基因的外源性amiRNA表達(dá)載體，瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，觀察外源性amiRNA介導(dǎo)的RNA干擾能否阻斷HBV和HBV復(fù)制相關(guān)的宿主基因表

3、達(dá)，通過測定靶基因的抑制程度和HBV蛋白以及HBVDNA降低的程度，從而了解靶向HBV和相關(guān)宿主基因的外源性amiRNA表達(dá)對HBV復(fù)制水平的影響。 目的：通過利用miRNA表達(dá)框架構(gòu)建能夠特異性靶向HBV和HBV感染和復(fù)制相關(guān)宿主基因的arniRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到HepG2.2.15細(xì)胞中，觀察外源性amiRNA介導(dǎo)的RNA干擾對HBV復(fù)制水平的影響。 方法：構(gòu)建13個(gè)靶向HBV不同位點(diǎn)、La蛋白基因和ASGPR1基

4、因的外源性amiRNA表達(dá)載體，測序證實(shí)插入序列的正確性。然后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，半定量RT-PCR方法觀察靶基因mRNA的抑制程度；Westem blotting方法觀察La蛋白和ASGPR1蛋白的抑制程度：測定培養(yǎng)上清中的HBsAg、HBeAg濃度和HBV DNA的水平，觀察靶向HBV、La蛋白基因和ASGPR1基因的外源性amiRNA對HBV復(fù)制和表達(dá)水平的影響。 結(jié)論： 1.

5、外源性amiRNA介導(dǎo)的RNA干擾能夠高效特異性的阻斷HBV的復(fù)制和表達(dá)。 2.外源性amiRNA介導(dǎo)的RNA干擾可以高效阻斷La和ASGPR1宿主靶基因的表達(dá)。 3.宿主基因La和ASGPR1的表達(dá)水平與HBV的復(fù)制和表達(dá)有密切關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)兩者在HBV的感染和復(fù)制中起著關(guān)鍵作用。與HBV感染和復(fù)制相關(guān)的宿主基因可以作為HBV基因治療的一個(gè)候選靶位。 4.在提高轉(zhuǎn)染效率的情況下，外源性amiRNA能夠作為一種