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文檔簡介
1、研究背景與目的:
炎癥性腸病( IBD)是一種腸道的非特異性慢性炎癥,包括潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病(CD),病因不明確,多與環(huán)境、遺傳、感染、免疫等因素有關。目前治療主要以抗炎、抑制免疫為主,但治療過程中可能出現(xiàn)復發(fā)、副作用等情況,如過敏、粒細胞減少等。研究發(fā)現(xiàn)合適的治療可以使約50%-60%患者對藥物治療有反應,20%-30%可以維持緩解。
大蒜是日常生活中常見的食品,被認為具有抗感染作用。在大蒜消耗
2、量高的人群中,胃腸道腫瘤的相對危險度有所下降。它可以促進腫瘤細胞的凋亡,并引起多種差異蛋白的表達,如Annexin I、Galectin、VDAC-1等。大蒜素是大蒜提取物,安全性較高,研究中發(fā)現(xiàn)有抗炎、促凋亡、抗腫瘤的作用。它可以抑制腫瘤細胞SW620、HCT116的生長,也抑制了NF-kB活化。NF-κB同時是IBD的關鍵環(huán)節(jié),大蒜素可能通過NF-κB發(fā)揮抗炎作用。
選擇和建立合適的動物模型是研究藥物治療不可缺少的重要
3、方法。IBD的動物模型制作方法多樣,化學性誘導是其中一種廣泛而穩(wěn)定的方法。TNBS灌腸法是其中一種,可以造成經(jīng)典的慢性結腸炎,從免疫類型分型看,近似于人類CD,誘導后可產(chǎn)生持續(xù)的炎癥病變。為了驗證大蒜素在體內(nèi)的抗炎作用,我們首先建立了大鼠結腸炎模型,通過藥物干預后各種炎癥指標的檢測,評價治療效果。
為了進一步研究大蒜素發(fā)揮抗炎作用的機制,我們選取了人類結腸腺癌上皮Caco-2細胞進行研究。它在體外培養(yǎng)生長達到融合后可自發(fā)分
4、化形成極性,表現(xiàn)出成熟腸道上皮細胞的形態(tài)結構和功能特征,是研究結腸上皮蛋白表達及其功能的理想細胞。IBD發(fā)生與進展過程中,NF-κB起著重要作用,該通路下游有很多作用靶點。多種炎癥因子等可使IκB磷酸化,亞基p65活化移入細胞核。而其活化可使IL-1β、TNF-α基因轉錄增強而高表達,它們又可再次激活NF-κB。IL-10是反向調節(jié)因子,IL-1β和TNF-α使其增加,IL-10又可阻斷NF-kB、TNF-α的活化[8]。NF-κB活性
5、指標也可以作為炎癥程度評估的標志。在哺乳動物中,MAPK通路廣泛存在,NF-κB是其中的一個作用靶點,它廣泛參與了細胞的炎癥、增殖、分化、凋亡等多個方面。MAPK通路高度保守,每條通路均有三級激酶參與,觸發(fā)的因素有多種生長因子、細胞因子、激素、蛋白等。通過級聯(lián)反應,最終可引起部分細胞因子分泌水平改變,進而體現(xiàn)生物作用,影響炎癥程度的改變和轉歸。MAPK通路的活化可使很多導致炎癥及免疫反應的細胞因子增加,如IL-1β、IL-6、IL-8、
6、TNF-α等。p38 MAPK通路在人類自身免疫中有重要意義,很多物理、化學因素刺激均可引起該通路激活,如紫外線輻射、激素、IL-1、TNF-α等細胞因子等,p38 MAPK可使核NF-κB復合體中的TATA結合蛋白發(fā)生磷酸化,從而調節(jié)NF-κB的轉錄活性;JNK通路在炎癥、凋亡、神經(jīng)發(fā)育中均起作用,可被輻射、環(huán)境因素及生長因子激活;ERK通路可依據(jù)刺激強度及持續(xù)時間調節(jié)細胞增殖、分化,有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可以使其活化后介導細胞凋亡。因此,
7、MAPK通路也可以成為抗炎治療的靶點,通過改變不同通路活性,最終影響炎癥程度。前期動物實驗中我們發(fā)現(xiàn),大蒜素可以改變大鼠血清炎癥因子水平。由此推測大蒜素可能通過影響MAPK通路活性,減少NF-κB p65向細胞核內(nèi)轉移,達到調控炎癥的目的。
我們利用IL-1β誘導Caco-2細胞,可以模擬腸道炎癥細胞狀態(tài),用以研究大蒜素對MAPK通路的作用。以大蒜素干預后,通過細胞上清炎癥因子檢測、核蛋白NF-κB p65含量檢測,明確大
8、蒜素對細胞的抗炎作用;進一步檢測細胞中p38、ERK、JNK通路變化,推測大蒜素抗炎作用的機制。
基于以上研究背景及理論基礎,本研究探討了大蒜素對于體內(nèi)、體外IBD的作用,其與MAPK通路的關系。內(nèi)容包括:
1、用TNBS誘導大鼠IBD模型;
2、觀察大蒜素單獨使用及分別與美沙拉嗪、柳氮磺吡啶聯(lián)合使用的療效;
3、在IL-1β誘導的Caco-2細胞中檢測大蒜素作用后MAPK通路的變
9、化。
方法:
1、80只Wistar大鼠分為空白對照組、TNBS模型組、大蒜素預防組(30mg/kg)、美沙拉嗪組(30mg/kg)、柳氮磺吡啶組(100mg/kg)、大蒜素灌胃組、美沙拉嗪聯(lián)合大蒜素組、柳氮磺吡啶聯(lián)合大蒜素組。大蒜素預防組在造模前以30mg/kg大蒜素灌胃,共2周。造模當日以50mg/kgTNBS乙醇溶液灌腸。造模24h后,空白對照組、模型組及大蒜素預防組大鼠分別以生理鹽水灌胃;美沙拉嗪組以
10、30mg/kg艾迪莎混懸液灌胃;柳氮磺吡啶組以100mg/kg柳氮磺吡啶混懸液灌胃;大蒜素組以30mg/kg灌胃;美沙拉嗪聯(lián)合大蒜素組及柳氮磺吡啶聯(lián)合大蒜素組分別為二者混懸液,劑量同上;每日1次,時間固定,持續(xù)14d。記錄各組大鼠體重變化,肉眼及內(nèi)鏡觀察結腸大體改變,用光學顯微鏡觀察大鼠結腸病理學變化。ELISA檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平。
2、選取Caco-2細胞株,利用不同濃度及時間的
11、大蒜素、IL-1β處理細胞,MTT檢測,確定安全范圍。細胞接種于直徑60mm培養(yǎng)皿中,分組:空白對照組、0.1ng/ml IL-1β組、1ng/ml IL-1β、10 ng/ml IL-1β組、10μg/ml大蒜素+1ng/mlIL-1β組、25μg/ml大蒜素+1ng/ml IL-1β組(含大蒜素組處理時先加入大蒜素,2h后加入IL-1β使終濃度為1ng/ml,持續(xù)培養(yǎng)至相應時間),各培養(yǎng)12h、24h、48h后收集細胞上清、核蛋白。
12、接種細胞于六孔板中,分組:空白對照組、1ng/mlIL-1β組、25μg/ml大蒜素組、25μg/ml大蒜素+1ng/ml IL-1β組,培養(yǎng)24h后收集細胞全蛋白。ELISA檢測細胞上清IL-8水平;Western blot檢測細胞核NF-κB p65含量及MAPK各通路磷酸化水平變化。
3、統(tǒng)計:數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟處理。組織評分數(shù)據(jù)進行多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wall
13、is H Test)。計量資料比較,方差齊性時采用One-way ANOVA檢驗,組間多重比較采用LSD-t檢驗;方差不齊時采用近似方差分析法Welch法,組間多重比較采用Dunnett T3檢驗;細胞上清IL-8濃度采用析因資料設計的方差分析。P<0.05表示差異顯著,有統(tǒng)計學意義。
結果:
1、大鼠體重:TNBS造模組2天后體重低于對照組。各治療組大鼠體重較造模組均有升高。大蒜素灌胃組、柳氮磺吡啶聯(lián)合大蒜
14、素組與美沙拉嗪聯(lián)合大蒜素治療組體重無顯著差異;至實驗結束,大蒜素灌胃組、美沙拉嗪組與美沙拉嗪聯(lián)合大蒜素組大鼠體重無顯著差異。
2、組織HE染色評分:造模組、大蒜素預防組、各治療組評分均高于空白對照組,顯示造模成功;與造模組比較,大蒜素預防組、各治療組評分均低于造模組,顯示預防和治療都有顯著保護作用,聯(lián)合美沙拉嗪使用,組織評分在治療組中最低。
3、TNBS組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平較空白組顯著升高;
15、各治療組TNF-α、IL-1β水平較TNBS組均有下降,但仍高于正常對照組;美沙拉嗪組、柳氮磺吡啶組無顯著差異;美沙拉嗪聯(lián)合大蒜素組二者含量最低。IL-4、IL-10水平在TNBS造模組顯著降低;與造模組相比,各治療組IL-4水平均有升高但低于對照組,美沙拉嗪聯(lián)合大蒜素組IL-4水平高于其它治療組;IL-10水平各治療組間無顯著差異。
4、梯度濃度的IL-1β刺激Caco-2細胞12h、24h、48h,ELISA檢測見細胞
16、上清IL-8含量在一定范圍內(nèi)隨IL-1β濃度增大及作用時間延長而增加。核蛋白western blot分析見:NF-κB p65亞基含量隨IL-1β濃度增大而增加。加入大蒜素預先干預后,核蛋白中NF-κB p65亞基含量較對照組升高,但相比1ng/ml IL-1β組,表達量有下降,25μg/ml大蒜素組下降更顯著;但上清IL-8含量變化不大。該趨勢在12h、24h、48h一致。
5、1ng/ml IL-1β可以激活p38、E
17、RK、JNK通路;提前2h加入25μg/ml大蒜素可減弱p38、ERK通路的活化,但可激活ERK通路;單獨加入25μg/ml大蒜素并不引起p38、JNK通路變化,可激活ERK通路。因此,大蒜素可抑制炎癥情況下p38、JNK的磷酸化,增強ERK活化。
結論:
本研究探討了大蒜素對在體動物炎癥性腸病模型的治療作用,尤其是與常規(guī)IBD治療藥物聯(lián)合應用的療效;并在離體腸上皮細胞中對其作用機制做出部分研究。通過實驗得到
18、以下結論:
1、TNBS可以成功誘導出大鼠結腸炎模型。大蒜素灌胃可以緩解該造模產(chǎn)生的炎癥,且治療效果優(yōu)于預防效果。單獨應用效果與美沙拉嗪及柳氮磺吡啶相比并無顯著差別,但大蒜素與美沙拉嗪聯(lián)合應用后,炎癥指標有明顯好轉。
2、IL-1β作用于Caco-2細胞可引起促炎因子IL-8的升高,這種現(xiàn)象有時間及濃度依賴性。大蒜素單獨用于Caco-2細胞并不引起IL-8的顯著變化,預先用于IL-1β誘導的Caco-2細胞,
19、也不會使IL-8含量有顯著升高或降低。
3、IL-1β誘導的Caco-2細胞核中,NF-κB p65亞基含量會隨其濃度的升高而增大。單獨以大蒜素刺激Caco-2細胞后,核內(nèi)NF-κB p65亞基含量并無明顯變化;但大蒜素刺激Caco-2細胞2h后,再以IL-1β誘導該細胞,可見細胞核內(nèi)NF-κB p65亞基含量較單獨使用IL-1β細胞下降,增加大蒜素濃度可增強這種作用。
4、大蒜素可以抑制細胞中p38、JNK
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