大蒜素對炎癥性腸病的治療作用及其對MAPK信號通路的影響.pdf

1、研究背景與目的:
　　 炎癥性腸病( IBD)是一種腸道的非特異性慢性炎癥，包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)，病因不明確，多與環(huán)境、遺傳、感染、免疫等因素有關(guān)。目前治療主要以抗炎、抑制免疫為主，但治療過程中可能出現(xiàn)復(fù)發(fā)、副作用等情況，如過敏、粒細(xì)胞減少等。研究發(fā)現(xiàn)合適的治療可以使約50％-60％患者對藥物治療有反應(yīng)，20％-30％可以維持緩解。
　　 大蒜是日常生活中常見的食品，被認(rèn)為具有抗感染作用。在大蒜消耗

2、量高的人群中，胃腸道腫瘤的相對危險度有所下降。它可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，并引起多種差異蛋白的表達(dá)，如Annexin I、Galectin、VDAC-1等。大蒜素是大蒜提取物，安全性較高，研究中發(fā)現(xiàn)有抗炎、促凋亡、抗腫瘤的作用。它可以抑制腫瘤細(xì)胞SW620、HCT116的生長，也抑制了NF-kB活化。NF-κB同時是IBD的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，大蒜素可能通過NF-κB發(fā)揮抗炎作用。
　　 選擇和建立合適的動物模型是研究藥物治療不可缺少的重要

3、方法。IBD的動物模型制作方法多樣，化學(xué)性誘導(dǎo)是其中一種廣泛而穩(wěn)定的方法。TNBS灌腸法是其中一種，可以造成經(jīng)典的慢性結(jié)腸炎，從免疫類型分型看，近似于人類CD，誘導(dǎo)后可產(chǎn)生持續(xù)的炎癥病變。為了驗證大蒜素在體內(nèi)的抗炎作用，我們首先建立了大鼠結(jié)腸炎模型，通過藥物干預(yù)后各種炎癥指標(biāo)的檢測，評價治療效果。
　　 為了進(jìn)一步研究大蒜素發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制，我們選取了人類結(jié)腸腺癌上皮Caco-2細(xì)胞進(jìn)行研究。它在體外培養(yǎng)生長達(dá)到融合后可自發(fā)分

4、化形成極性，表現(xiàn)出成熟腸道上皮細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能特征，是研究結(jié)腸上皮蛋白表達(dá)及其功能的理想細(xì)胞。IBD發(fā)生與進(jìn)展過程中，NF-κB起著重要作用，該通路下游有很多作用靶點(diǎn)。多種炎癥因子等可使IκB磷酸化，亞基p65活化移入細(xì)胞核。而其活化可使IL-1β、TNF-α基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)而高表達(dá)，它們又可再次激活NF-κB。IL-10是反向調(diào)節(jié)因子，IL-1β和TNF-α使其增加，IL-10又可阻斷NF-kB、TNF-α的活化[8]。NF-κB活性

5、指標(biāo)也可以作為炎癥程度評估的標(biāo)志。在哺乳動物中，MAPK通路廣泛存在，NF-κB是其中的一個作用靶點(diǎn)，它廣泛參與了細(xì)胞的炎癥、增殖、分化、凋亡等多個方面。MAPK通路高度保守，每條通路均有三級激酶參與，觸發(fā)的因素有多種生長因子、細(xì)胞因子、激素、蛋白等。通過級聯(lián)反應(yīng)，最終可引起部分細(xì)胞因子分泌水平改變，進(jìn)而體現(xiàn)生物作用，影響炎癥程度的改變和轉(zhuǎn)歸。MAPK通路的活化可使很多導(dǎo)致炎癥及免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子增加，如IL-1β、IL-6、IL-8、

6、TNF-α等。p38 MAPK通路在人類自身免疫中有重要意義，很多物理、化學(xué)因素刺激均可引起該通路激活，如紫外線輻射、激素、IL-1、TNF-α等細(xì)胞因子等，p38 MAPK可使核NF-κB復(fù)合體中的TATA結(jié)合蛋白發(fā)生磷酸化，從而調(diào)節(jié)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性;JNK通路在炎癥、凋亡、神經(jīng)發(fā)育中均起作用，可被輻射、環(huán)境因素及生長因子激活;ERK通路可依據(jù)刺激強(qiáng)度及持續(xù)時間調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化，有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可以使其活化后介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，

7、MAPK通路也可以成為抗炎治療的靶點(diǎn)，通過改變不同通路活性，最終影響炎癥程度。前期動物實驗中我們發(fā)現(xiàn)，大蒜素可以改變大鼠血清炎癥因子水平。由此推測大蒜素可能通過影響MAPK通路活性，減少NF-κB p65向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，達(dá)到調(diào)控炎癥的目的。
　　 我們利用IL-1β誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞，可以模擬腸道炎癥細(xì)胞狀態(tài)，用以研究大蒜素對MAPK通路的作用。以大蒜素干預(yù)后，通過細(xì)胞上清炎癥因子檢測、核蛋白NF-κB p65含量檢測，明確大

8、蒜素對細(xì)胞的抗炎作用;進(jìn)一步檢測細(xì)胞中p38、ERK、JNK通路變化，推測大蒜素抗炎作用的機(jī)制。
　　 基于以上研究背景及理論基礎(chǔ)，本研究探討了大蒜素對于體內(nèi)、體外IBD的作用，其與MAPK通路的關(guān)系。內(nèi)容包括:
　　 1、用TNBS誘導(dǎo)大鼠IBD模型;
　　 2、觀察大蒜素單獨(dú)使用及分別與美沙拉嗪、柳氮磺吡啶聯(lián)合使用的療效;
　　 3、在IL-1β誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞中檢測大蒜素作用后MAPK通路的變

9、化。
　　 方法:
　　 1、80只Wistar大鼠分為空白對照組、TNBS模型組、大蒜素預(yù)防組(30mg/kg)、美沙拉嗪組（30mg/kg）、柳氮磺吡啶組(100mg/kg)、大蒜素灌胃組、美沙拉嗪聯(lián)合大蒜素組、柳氮磺吡啶聯(lián)合大蒜素組。大蒜素預(yù)防組在造模前以30mg/kg大蒜素灌胃，共2周。造模當(dāng)日以50mg/kgTNBS乙醇溶液灌腸。造模24h后，空白對照組、模型組及大蒜素預(yù)防組大鼠分別以生理鹽水灌胃;美沙拉嗪組以

10、30mg/kg艾迪莎混懸液灌胃;柳氮磺吡啶組以100mg/kg柳氮磺吡啶混懸液灌胃;大蒜素組以30mg/kg灌胃;美沙拉嗪聯(lián)合大蒜素組及柳氮磺吡啶聯(lián)合大蒜素組分別為二者混懸液，劑量同上;每日1次，時間固定，持續(xù)14d。記錄各組大鼠體重變化，肉眼及內(nèi)鏡觀察結(jié)腸大體改變，用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠結(jié)腸病理學(xué)變化。ELISA檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平。
　　 2、選取Caco-2細(xì)胞株，利用不同濃度及時間的

11、大蒜素、IL-1β處理細(xì)胞，MTT檢測，確定安全范圍。細(xì)胞接種于直徑60mm培養(yǎng)皿中，分組:空白對照組、0.1ng/ml IL-1β組、1ng/ml IL-1β、10 ng/ml IL-1β組、10μg/ml大蒜素+1ng/mlIL-1β組、25μg/ml大蒜素+1ng/ml IL-1β組（含大蒜素組處理時先加入大蒜素，2h后加入IL-1β使終濃度為1ng/ml，持續(xù)培養(yǎng)至相應(yīng)時間），各培養(yǎng)12h、24h、48h后收集細(xì)胞上清、核蛋白。

12、接種細(xì)胞于六孔板中，分組:空白對照組、1ng/mlIL-1β組、25μg/ml大蒜素組、25μg/ml大蒜素+1ng/ml IL-1β組，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞全蛋白。ELISA檢測細(xì)胞上清IL-8水平;Western blot檢測細(xì)胞核NF-κB p65含量及MAPK各通路磷酸化水平變化。
　　 3、統(tǒng)計:數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟處理。組織評分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行多個獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wall

13、is H Test)。計量資料比較，方差齊性時采用One-way ANOVA檢驗，組間多重比較采用LSD-t檢驗;方差不齊時采用近似方差分析法Welch法，組間多重比較采用Dunnett T3檢驗;細(xì)胞上清IL-8濃度采用析因資料設(shè)計的方差分析。P＜0.05表示差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、大鼠體重:TNBS造模組2天后體重低于對照組。各治療組大鼠體重較造模組均有升高。大蒜素灌胃組、柳氮磺吡啶聯(lián)合大蒜

14、素組與美沙拉嗪聯(lián)合大蒜素治療組體重?zé)o顯著差異;至實驗結(jié)束，大蒜素灌胃組、美沙拉嗪組與美沙拉嗪聯(lián)合大蒜素組大鼠體重?zé)o顯著差異。
　　 2、組織HE染色評分:造模組、大蒜素預(yù)防組、各治療組評分均高于空白對照組，顯示造模成功;與造模組比較，大蒜素預(yù)防組、各治療組評分均低于造模組，顯示預(yù)防和治療都有顯著保護(hù)作用，聯(lián)合美沙拉嗪使用，組織評分在治療組中最低。
　　 3、TNBS組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平較空白組顯著升高;

15、各治療組TNF-α、IL-1β水平較TNBS組均有下降，但仍高于正常對照組;美沙拉嗪組、柳氮磺吡啶組無顯著差異;美沙拉嗪聯(lián)合大蒜素組二者含量最低。IL-4、IL-10水平在TNBS造模組顯著降低;與造模組相比，各治療組IL-4水平均有升高但低于對照組，美沙拉嗪聯(lián)合大蒜素組IL-4水平高于其它治療組;IL-10水平各治療組間無顯著差異。
　　 4、梯度濃度的IL-1β刺激Caco-2細(xì)胞12h、24h、48h，ELISA檢測見細(xì)胞

16、上清IL-8含量在一定范圍內(nèi)隨IL-1β濃度增大及作用時間延長而增加。核蛋白western blot分析見:NF-κB p65亞基含量隨IL-1β濃度增大而增加。加入大蒜素預(yù)先干預(yù)后，核蛋白中NF-κB p65亞基含量較對照組升高，但相比1ng/ml IL-1β組，表達(dá)量有下降，25μg/ml大蒜素組下降更顯著;但上清IL-8含量變化不大。該趨勢在12h、24h、48h一致。
　　 5、1ng/ml IL-1β可以激活p38、E

17、RK、JNK通路;提前2h加入25μg/ml大蒜素可減弱p38、ERK通路的活化，但可激活ERK通路;單獨(dú)加入25μg/ml大蒜素并不引起p38、JNK通路變化，可激活ERK通路。因此，大蒜素可抑制炎癥情況下p38、JNK的磷酸化，增強(qiáng)ERK活化。
　　 結(jié)論:
　　 本研究探討了大蒜素對在體動物炎癥性腸病模型的治療作用，尤其是與常規(guī)IBD治療藥物聯(lián)合應(yīng)用的療效;并在離體腸上皮細(xì)胞中對其作用機(jī)制做出部分研究。通過實驗得到

18、以下結(jié)論:
　　 1、TNBS可以成功誘導(dǎo)出大鼠結(jié)腸炎模型。大蒜素灌胃可以緩解該造模產(chǎn)生的炎癥，且治療效果優(yōu)于預(yù)防效果。單獨(dú)應(yīng)用效果與美沙拉嗪及柳氮磺吡啶相比并無顯著差別，但大蒜素與美沙拉嗪聯(lián)合應(yīng)用后，炎癥指標(biāo)有明顯好轉(zhuǎn)。
　　 2、IL-1β作用于Caco-2細(xì)胞可引起促炎因子IL-8的升高，這種現(xiàn)象有時間及濃度依賴性。大蒜素單獨(dú)用于Caco-2細(xì)胞并不引起IL-8的顯著變化，預(yù)先用于IL-1β誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞，

19、也不會使IL-8含量有顯著升高或降低。
　　 3、IL-1β誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞核中，NF-κB p65亞基含量會隨其濃度的升高而增大。單獨(dú)以大蒜素刺激Caco-2細(xì)胞后，核內(nèi)NF-κB p65亞基含量并無明顯變化;但大蒜素刺激Caco-2細(xì)胞2h后，再以IL-1β誘導(dǎo)該細(xì)胞，可見細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65亞基含量較單獨(dú)使用IL-1β細(xì)胞下降，增加大蒜素濃度可增強(qiáng)這種作用。
　　 4、大蒜素可以抑制細(xì)胞中p38、JNK