防御素在炎癥性腸病發(fā)病機制中的作用及其分子機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的 炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病機制涉及遺傳、環(huán)境、免疫反應(yīng)等,但真正的致病元兇尚不清楚。腸粘膜可直接產(chǎn)生免疫效應(yīng)分子對抗腸腔內(nèi)微生物,或通過信號傳導(dǎo)啟動粘膜獲得性免疫反應(yīng),介導(dǎo)直接的粘膜保護反應(yīng)。防御素是一類非常重要的免疫效應(yīng)分子。β防御素-2誘導(dǎo)性表達于上皮細胞,發(fā)揮抗微生物活性。本課題利用惡唑酮小鼠結(jié)腸炎模型研究結(jié)腸粘膜組織中β防御素-2與促炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β的表達以及相互關(guān)系,探討β防御素-2表達的調(diào)控機

2、制,旨在探索結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)擴大的原因。 材料與方法 1.建立小鼠惡唑酮結(jié)腸炎模型,進行大體和組織病理學(xué)評價。2.免疫組化方法測定小鼠結(jié)腸粘膜β防御素-2、TNF-α、IL-1 β、NF-κ Bp65、ERK-1、pERK蛋白表達。3.熒光定量RT-PCR測定小鼠結(jié)腸粘膜β防御素-2、TNF-α、IL-l β和NF-κ Bp65mRNA的表達。4.Western B1otting蛋白印跡測定小鼠結(jié)腸粘膜β防御素-2蛋白的表

3、達。5.ELISA測定兩組結(jié)腸粘膜組織上清液中TNF-α和IL-1 β的表達。6.細胞培養(yǎng):Caco 2細胞株加LPS刺激,再與HBD2抗體共同孵育。實時熒光定量PCR檢測不同時段TNF-α和IL-1β的mRNA表達變化情況。 結(jié)果 1.小鼠惡唑酮結(jié)腸炎造模成功,小鼠結(jié)腸粘膜有肉眼和組織學(xué)炎癥。2.免疫組化檢測到β防御素-2在β組結(jié)腸粘膜表達顯著高于A組(p

4、達顯著高于A組(p

5、mRNA表達水平B組顯著高于A組,兩組比較有顯著性差異(p

6、組,兩組比較有顯著性差異(p<0.05)。 結(jié)論 1.惡唑酮結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸粘膜β防御素-2的表達顯著高于正常對照組。促炎因子TNF-α和IL-1β的表達顯著高于對照組,且與β防御素-2的表達呈平行關(guān)系。說明β防御素-2的表達與促炎因子的表達密切相關(guān),兩者相加可能是結(jié)腸炎癥反應(yīng)放大、持續(xù)遷延的原因之一。2.惡唑酮結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸粘膜NF-kBp65、ERK-1、pERK表達顯著高于正常對照組,且與β防御素-2的表達呈正相關(guān)

7、,推測β防御素-2的誘導(dǎo)表達涉及NF-kB和MAPK等多條細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路。3.阻斷β防御素-2后,下調(diào)Caco2細胞株對TNF-α和IL-1βmRNA水平的表達,及其具有時效關(guān)系,提示HBD2可能促進TNF-α和IL-1β的分泌,在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中有重要作用。 目的 采用Oxazolone小鼠結(jié)腸炎模型進行研究,給予小鼠益生菌混合制劑VSL[#]3干預(yù),觀察對小鼠結(jié)腸炎的預(yù)防治療作用及其對β防御素-2、TNF-α、IL

8、-1 β、NF-κ Bp65、ERK-1和pERK表達的影響,從分子水平探討腸道益生菌減輕炎癥反應(yīng)的作用機制,為進一步臨床應(yīng)用益生菌治療IBD奠定理論基礎(chǔ)。 材料與方法 1.建立小鼠惡唑酮結(jié)腸炎模型并分組:6-8周齡健康雌性Balb/c小鼠分兩組,即治療組和預(yù)防組。每組又分為三個亞組,即VSL[#]3預(yù)防組、SASP預(yù)防組、預(yù)防對照組;VSL[#]3治療組、SASP治療組、治療對照組。然后取結(jié)腸組織進行大體和組織病理學(xué)

9、評價VSL[#]3的療效。2.免疫組化方法檢測各組結(jié)腸粘膜組織中β防御素-2、TNF-α、IL-1 β的表達情況,以及NF-k Bp65、ERK-1和pERK的表達情況。3.RT-PCR技術(shù)檢測各組結(jié)腸組織中β防御素-2、TNF-α、IL-1 β、NF-k Bp65mRNA 的表達情況。4.Western blot方法檢測各組小鼠結(jié)腸粘膜β防御素-2的蛋白表達情況。5.ELISA方法檢測各組小鼠結(jié)腸粘膜組織上清液中TNF-α、IL-1β

10、蛋白表達情況。 結(jié)果 1.VSL[#]預(yù)防組和治療組小鼠結(jié)腸粘膜病變的大體和組織病理學(xué)評分顯著低于預(yù)防對照組和治療對照組(p<0.05),與SASP預(yù)防組和治療組比較無顯著性差異(p>0.05)。2.免疫組化方法檢測VSL[#]3預(yù)防組和VSL[#]3治療組結(jié)腸粘膜組織中β防御素-2、TNF-α、IL-1β、的表達顯著低于預(yù)防對照組和治療對照組(p<0.05),與SASP預(yù)防組和治療組比較沒有顯著性差異(p>0.05)

11、。VSL[#]3預(yù)防組和治療組結(jié)腸粘膜組織中NF-K Bp65、ERK-1和pERK蛋白的表達與對照組比較顯著下調(diào)(p>0.05)。3.RT-PCR檢測VSL[#]預(yù)防組和VSL[#]治療組結(jié)腸粘膜組織中β防御素-2、TNF-α、IL-1β和NF-kBp65mRNA表達顯著低于預(yù)防對照組和治療對照組(p<0.05),與SASP預(yù)防組和SASP治療組比較沒有顯著性差異(p>0.05)。4.Western blot方法檢測VSL[#]3預(yù)防

12、組和治療組結(jié)腸粘膜β防御素-2的蛋白表達顯著低于預(yù)防對照組和治療對照組(p<0.05)。5.ELISA方法檢測VSL[#]3預(yù)防組和治療組結(jié)腸粘膜組織上清液中TNF-α、IL-1β蛋白表達顯著低于預(yù)防對照組和治療對照組(p<0.05)。 結(jié)論 1.VSL[#]3對惡唑酮誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎有預(yù)防作用和治療作用。2.VSL[#]3預(yù)防治療惡唑酮誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的機制可能與下調(diào)促炎因子和β防御素-2的表達有關(guān)。3.VSL[#]

13、3下調(diào)促炎因子和β防御素-2的表達可能涉及NF-κB和MAPKs等多條細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路。 目的 本研究檢測人類潰瘍性結(jié)腸炎(UC)結(jié)腸粘膜中HBD2和TNF-α、IL-1 β在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的表達,探討防御素和細胞因子表達之間的關(guān)系,以及在UC發(fā)生發(fā)展中的作用。同時檢測了UC結(jié)腸粘膜中NF-κ Bp65的表達和MAPKs通路中ERK-1和pERK在結(jié)腸粘膜組織中的表達,旨在探討UC患者中HBD2激活的信號傳導(dǎo)通路,

14、以及在UC發(fā)病中的作用。 材料與方法 1.選擇2004.12~2005.12四川大學(xué)華西醫(yī)院消化科確診的UC患者,計算疾病活動度(LJCAI),對UC進行病理學(xué)分級。2.免疫組化方法檢測UC和正常對照組結(jié)腸粘膜中HBD2和TNF-α、IL-l β的表達,以及NF-κ Bp65、ERK-1和pERK的表達。3.實時熒光定量RT-PCR方法測定UC患者和正常對照組中HBD2、TNF-α、IL-l β、NF-κ Bp65 m

15、RNA在轉(zhuǎn)錄水平的表達。4.Western blot方法檢測UC患者和正常對照組結(jié)腸粘膜HBD2蛋白的表達。5.ELISA方法檢測UC患者和正常對照組結(jié)腸粘膜TNF-α、IL-1β蛋白的表達。 結(jié)果 1.35例UC患者中輕度10例,中度13例,重度12例。病理分級Ⅰ級11例,Ⅱ級13例,Ⅲ級11例。IJCA工評分與病理分級之間呈正相關(guān)(p<0.05)。2.免疫組化方法發(fā)現(xiàn)HBD2、TNF-α、IL-1β在UC結(jié)腸粘膜的

16、表達顯著高于對照組,陽性率隨病理學(xué)分級增高而逐漸增高(p<0.05),炎癥粘膜區(qū)表達顯著高于非炎癥粘膜區(qū)(p<0.05);NF-κ Bp65、ERK-1和pERK表達在UC患者顯著高于正常對照組(p<0.05),炎癥粘膜區(qū)顯著高于非炎癥粘膜區(qū)(p<0.05)。HBD2與TNF-α、IL-1β、NF-κ Bp65、ERK-l和pERK的表達呈正相關(guān)。3.實時熒光定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)HBD2、TNF-α、IL-1 β、NF-κ Bp65

17、mRNA在UC結(jié)腸粘膜的表達顯著高于對照組,隨病理學(xué)分級增高逐漸增強(p<0.05),炎癥粘膜區(qū)表達顯著高于非炎癥粘膜區(qū),HBD2與TNF-α、IL-l β、NF-κ Bp65的表達間呈正相關(guān)。4.western blot證實UC結(jié)腸上皮HBD2的表達顯著高于正常對照組(p<0.05),且炎癥粘膜區(qū)顯著高于非炎癥粘膜區(qū)(p<0.05)。5.ELISA檢測結(jié)果顯示UC結(jié)腸上皮TNF-α、IL-1 β蛋白表達顯著高于正常對照組(p<0.05

18、),且炎癥粘膜區(qū)顯著高于非炎癥粘膜區(qū)(p<0.05)。 結(jié)論 1.UC結(jié)腸粘膜HBD2表達顯著高于正常對照組、炎癥粘膜部位顯著高于非炎癥粘膜部位,且與促炎因子TNF α和IL-β的表達呈正相關(guān),提示HBD2和促炎因子互為因果、互相誘生,使炎癥反應(yīng)不斷放大、使UC炎癥損傷不斷加重。2.UC結(jié)腸粘膜NF-κ Bp65、ERK-1和pERK的表達顯著高于正常對照組,且與HBD2的表達呈正相關(guān),提示HBD2在UC結(jié)腸粘膜中的上

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