熱休克蛋白90抑制劑17-丙烯胺-17-去甲氧格爾德霉素誘導Kasumi-1細胞凋亡和分化及其機制探討.pdf

1、熱休克蛋白90(HSP90)是一種分子伴侶，它能協(xié)助錯誤折疊的蛋白發(fā)生重新折疊，一旦蛋白發(fā)生了不可逆損傷，它便起輔助清除作用。重要的是，多種HSP90的客戶蛋白是與腫瘤發(fā)生有關(guān)的原癌蛋白，因而以它作為靶標的靶向治療藥物具有較大的研究價值，并有望成為一類新型抗癌藥物。 17-丙烯胺-17-去甲氧格爾德霉素(17AAG)是一種苯醌安沙霉素抗生素格爾德霉素(GA)的衍生物，它能與HSP90結(jié)合，促使HSP90所伴隨的對腫瘤細胞的增殖和

2、存活起重要作用的蛋白發(fā)生降解，而具有顯著的抗腫瘤活性。 原癌基因c-kit編碼一種Ⅲ型跨膜酪氨酸激酶，即KIT蛋白(CD117)，是干細胞因子(SCF)受體。急性髓細胞性白血病(AML)60％～80％的患者髓系原始細胞表達CD117，原癌基因c-kit發(fā)生突變能導致KIT蛋白組成性激活。越來越多的證據(jù)表明c-kit突變與白血病的發(fā)生有關(guān)。有研究證實KIT抑制劑能誘導AML原始細胞發(fā)生凋亡。 白血病的發(fā)生往往需要雙重打擊。

3、在AML1-ETO+AML中，小鼠實驗及多項人體研究證實單純AML1-ETO的表達不足以誘導白血病的發(fā)生，它僅僅提供了一種抑制分化的打擊信號，而KIT組成性激活提供白血病發(fā)生的另一個打擊信號，它使惡性細胞獲得增殖及存活優(yōu)勢。為了研究HSP90抑制劑17AAG對KIT突變+AML的生物學作用并探討其作用機制，本文完成了下列研究工作：1.17AAG對Kasumi-1細胞的生物學作用 發(fā)現(xiàn)HSP90抑制劑17AAG明顯抑制Kasumi

4、-1細胞的生長，半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.62μmol/L；17AAG誘導Kasumi-1細胞凋亡，呈時間、劑量依賴性，處理24h早期凋亡細胞增加，處理48h晚期凋亡細胞增加，早期凋亡細胞減少。17AAG可誘導Kasumi-1細胞髓系分化抗原CD11b及CD15表達增加，并呈劑量和時間依賴性。經(jīng)17AAG作用后細胞阻滯于G0/G1期，伴有S期細胞減少。 17AAG能抑制Kasumi-1細胞的生長，且能誘導其發(fā)生凋亡、分化并使

5、細胞周期阻滯于G0/G1期。為進一步研究其作用機制提供實驗基礎。 2.17AAG誘導Kasumi-1細胞凋亡及分化的作用機制研究進一步研究17AAG誘導Kasumi-1細胞凋亡及分化的作用機制發(fā)現(xiàn)，17AAG能降低發(fā)生Asn822Lys突變的KIT蛋白及其磷酸化水平，并呈時間和劑量依賴性，其磷酸化水平降低程度較蛋白水平更為明顯且迅速，表明KIT磷酸化形式更需要HSP90的伴侶，但并不影響c-kitmRNA水平。17AAG處理Ka

6、sumi-1細胞后檢測細胞內(nèi)KIT下游信號分子AKT及STAT3水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總STAT3蛋白水平?jīng)]有變化，但其磷酸化水平則呈劑量依賴性降低。已經(jīng)證實AKT是HSP90的客戶蛋白之一，我們的研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)17AAG處理后Kasumi-1細胞內(nèi)AKT蛋白及其磷酸化水平均發(fā)生降低，且其磷酸化水平較蛋白水平降低更為迅速并明顯。但Kasumi-1細胞中另一重要的致病性標志AML1-ETO融合蛋白并沒有發(fā)生變化。免疫共沉淀方法提示17AAG作用后K

7、IT與HSP90發(fā)生解離。 因此，17AAG通過降低KIT蛋白水平而發(fā)揮作用，檢測KIT下游信號分子水平進一步證實了17AAG對KIT的作用；同時，與其他研究組所證實的一樣，我們也發(fā)現(xiàn)17AAG能降解其所伴侶的AKT蛋白；此外，17AAG對AML1-ETO并沒有降解作用。結(jié)果表明發(fā)生Asn822Lys突變的KIT蛋白也是17AAG的客戶蛋白之一。 3.17AAG聯(lián)合HDAC競爭性抑制劑苯丁酸鈉(PB)對Kasumi-1細

8、胞的作用苯丁酸鈉(PB)是HDAC競爭性抑制劑，應用HDAC抑制劑阻斷AML1-ETO的生物學功能，逆轉(zhuǎn)由HDAC募集而導致的基因表達受抑，從而治療t(8；21)/AML白血病。我們實驗室通過體外和體內(nèi)實驗均證明HDAC抑制劑PB能夠抑制AML-M2b白血病細胞生長和自我更新，使細胞阻滯于G0/G1期，誘導細胞部分分化和凋亡。我們聯(lián)合17AAG及PB處理Kasumi-1細胞系，發(fā)現(xiàn)PB能增強17AAG抗AML-M2b的作用，17AAG對

9、Kasumi-1細胞的半數(shù)抑制率(IC50)由單用時的0.6439μM降至0.3437μM；且聯(lián)合用藥所誘導的細胞凋亡及分化作用均明顯強于分別單獨應用兩種藥物；聯(lián)合作用能使細胞阻滯于G2/M期，而非單用17AAG導致的G0/G1期阻滯。此外，17AAG能抑制AML-M2b原代細胞的生長，降低細胞的自我更新能力。 聯(lián)合應用化療藥物是目前克服白血病耐藥的主要方法之一，本項研究為白血病的治療提供了新的藥物及聯(lián)合方式的選擇，也為將來應用

10、于臨床提供實驗依據(jù)。 4.17AAG對原代細胞的作用為了進一步證實17AAG對AML的作用，我們選擇了8例初治原發(fā)AML-M2b患者及4例初治原發(fā)AML-M3患者，這8例AML-M2b患者均高表達CD117。結(jié)果發(fā)現(xiàn)17AAG能抑制所有8例患者骨髓單個核細胞的體外生長，并誘導其發(fā)生凋亡及分化；小劑量PB能增強17AAG的生長抑制作用。4例AML-M3患者均不表達CD117，17AAG對其生長抑制作用明顯弱于AML-M2b患者。

11、 實驗結(jié)果表明17AAG對高表達CD117的AML-M2b原代細胞也有生物學作用，因而17AAG有望成為治療AML的一類新型化療藥物。 綜上所述，本研究證實17AAG能誘導Kasumi-1細胞發(fā)生凋亡、分化及G0/G1期周期阻滯；進一步研究其作用機制，結(jié)果提示17AAG通過降解突變KIT蛋白并下調(diào)其下游信號分子而發(fā)揮作用；小劑量PB能增強17AAG對Kasumi-1細胞的生物學作用；此外17AAG對高表達CD117的AML