HDAC抑制劑Depsipeptide對Hsp90功能的影響及其誘導細胞分化機制探討.pdf

1、研究背景：熱休克蛋白(heatshockproteins，Hsp)是細胞內最重要的分子伴侶分子，除去參與細胞內一些重要蛋白分子的構象、穩(wěn)定性及激酶活性調節(jié)之外，熱休克蛋白的另一重要生理功能是對應激狀態(tài)下的細胞提供保護。近年來的實驗研究發(fā)現，在熱休克蛋白的家族成員中，Hsp90分子具有特殊的分子伴侶功能，參與了眾多與腫瘤增殖和凋亡調控信號相關的分子構象與穩(wěn)定性的調節(jié)，在腫瘤細胞的異常增殖、藥物耐受及抗凋亡信號通路活化等方面扮演著重要的角色

2、。在Hsp90的結合靶蛋白中包含了腫瘤特異性的蛋白(如突變型p53、Bcr-Abl融合蛋白)；激酶蛋白(如v-Src、ErbB2、Raf-1，Akt，Cdk4、Cdk6等)；細胞膜生長因子受體(表皮生長因子受體EGFR、血小板源性生長因子受體PDGF-R、胰島素生長因子受體IGF-R等)；核內受體(雌激素受體、雄激素受體)等等。由于這些靶蛋白在腫瘤細胞增殖信號轉導及抗凋亡過程中扮演著舉足輕重的角色，通過抑制Hsp90的功能而清除這些蛋白

3、分子或滅活其激酶活性無疑具有明顯的抗腫瘤優(yōu)勢。 組蛋白去乙?；敢种苿?histonedeacetylaseinhibitor，HDACi)，是一類高效、低毒的抗腫瘤新藥，具有抑制細胞生長，誘導細胞分化及凋亡的作用特點，但對其抗腫瘤作用機理迄今為止尚不十分清楚。由于HDACi能增加細胞核染色質上核小體組蛋白的乙?；揎棾潭?，導致染色質結構變?yōu)楦娱_放，從而激活一些基因的轉錄，因而人們推測其抗腫瘤作用與組蛋白乙酰化介導的基因活化相

4、關。但迄今為止，盡管人們采用了包括基因芯片檢測手段在內的各種方法仍無法找出真正與HDACi抗腫瘤作用直接相關的活化基因，同時也有實驗表明由HDACi誘導增加的乙酰化組蛋白本身與HDACi引起的細胞生長抑制間沒有相關性，這些結果使人們開始關注HDACi抗腫瘤作用的其他可能的機制。2002年人們首次發(fā)現HDACi可以通過乙?；揎椂绊懩[瘤細胞中Hsp90的功能，伴隨Hsp90分子的乙?；?，多種Hsp90結合靶蛋白相應被清除從而介導細胞凋亡

5、發(fā)生。 在Hsp90眾多的底物蛋白中，v-Src是最早發(fā)現的底物蛋白之一，其同源的真核細胞c-Src做為細胞內一種重要的非受體型酪氨酸激酶，參與并調控多條與細胞增殖、抗凋亡相關的信號轉導途徑，影響著細胞骨架的構建和對胞外基質的粘附。目前的研究表明，HDACi可以誘導Src基因轉化細胞的分化，但其作用機制不清。本研究中我們通過基因轉染技術建立了穩(wěn)定高表達Src基因的細胞轉化模型，進而以此細胞為研究對象，探討了HDACi對細胞分化的

6、影響，同時對比阻斷型Hsp90抑制劑的作用特點，檢測了HDACi對Src激酶表達及其與Hsp90結合功能的影響，力圖從全新的角度闡明HDACi誘導細胞分化的作用機制。 研究內容及結果： 1.建立高表達Src基因的轉化細胞模型 通過真核基因轉染技術將野生型Src基因導入NIH3T3細胞，經G418加壓篩選，獲得Src穩(wěn)定高表達的細胞模型3T3-Src；3T3-Src細胞的體外增殖、集落形成、半固體克隆形成及對胞外基

7、質粘附能力與空載體轉染細胞3T3-mock相比均獲得明顯增強。 2.觀察HDAC抑制劑Depsipeptide(DP)誘導3T3-Src細胞分化的作用 DP可明顯抑制細胞增殖，阻斷細胞周期于G0/G1期，并可呈時間依賴性誘導細胞凋亡。藥物處理后3T3-Src的細胞形態(tài)發(fā)生上皮樣改變，免疫熒光染色顯示經DP處理24-48h后細胞骨架排列發(fā)生變化，細胞分化標志之一肌動蛋白應激纖維(Actinstressfibers)的表達明

8、顯增強，同時伴有Gelsolin的水平降低及胞外基質粘附能力的改變。蛋白印記檢測顯示DP可以明顯增強細胞內p21蛋白的表達水平，增強組蛋白H3的乙酰化，但骨架蛋白tubulin的乙?；轿匆娫鰪?，提示DP對HDAC6沒有抑制作用。 3.探討DP對熱休克蛋白90功能的影響及其誘導細胞分化和凋亡的作用機制以阻斷型Hsp90抑制劑Geldanamycin(GA)為陽性對照，我們檢測了DP處理之后不同時相點細胞內多種Hsp90底物蛋白

9、水平的變化，結果表明伴隨Hsp90乙?；潭鹊脑鰪?，其底物蛋白Raf-1、Akt及CDK4激酶水平明顯降低，提示Hsp90乙?；呀涀钄嗔似浞肿影閭H功能。由于Raf-1和Akt蛋白的清除，細胞內重要的ERK及PI3K/AKT信號通路被阻斷，直接介導了細胞凋亡的發(fā)生。在對Src蛋白的檢測中我們發(fā)現，DP可以同GA一樣清除內源性Src蛋白，但由于HDACi具有活化CMV啟動子的特性，伴隨DP的處理，3T3-Src細胞中外源Src蛋白的表達獲

10、得明顯增強，同時伴有增強的Src乙?；揎?。值得注意的是盡管Src的蛋白水平增加，其與Hsp90間的結合并不能相應獲得增強，伴隨DP的處理，Src蛋白的降解也明顯增加。HDACi可以乙?；疕sp90及其底物蛋白Src現象的發(fā)現，提示乙酰化修飾可能同時影響Hsp90及其底物蛋白分子的構象，即Hsp90分子伴侶功能的抑制可能是構成該復合體的分子均發(fā)生乙酰化修飾的結果。這一發(fā)現有助于更好地闡明HDAC抑制劑阻斷Hsp90功能的作用機制，具有重

11、要的意義。DP通過抑制Hsp90的分子伴侶功能清除Src蛋白，可能是DP誘導Src基因轉化細胞分化的主要作用機制。 結論：1.HDAC抑制劑DP可以誘導Src基因轉染的3T3-Src細胞發(fā)生細胞分化，表現為細胞增殖能力降低，細胞形態(tài)和粘附特性發(fā)生改變。 2.DP可以通過增強Hsp90的乙酰化而明顯阻斷Hsp90的分子伴侶功能，表現為細胞內多種Hsp90底物蛋白如c-Src，Raf-1，Akt及CDK4激酶等被清除，這些底