HDAC抑制劑Depsipeptide對(duì)Hsp90功能的影響及其誘導(dǎo)細(xì)胞分化機(jī)制探討.pdf

1、研究背景：熱休克蛋白(heatshockproteins，Hsp)是細(xì)胞內(nèi)最重要的分子伴侶分子，除去參與細(xì)胞內(nèi)一些重要蛋白分子的構(gòu)象、穩(wěn)定性及激酶活性調(diào)節(jié)之外，熱休克蛋白的另一重要生理功能是對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞提供保護(hù)。近年來的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在熱休克蛋白的家族成員中，Hsp90分子具有特殊的分子伴侶功能，參與了眾多與腫瘤增殖和凋亡調(diào)控信號(hào)相關(guān)的分子構(gòu)象與穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，在腫瘤細(xì)胞的異常增殖、藥物耐受及抗凋亡信號(hào)通路活化等方面扮演著重要的角色

2、。在Hsp90的結(jié)合靶蛋白中包含了腫瘤特異性的蛋白(如突變型p53、Bcr-Abl融合蛋白)；激酶蛋白(如v-Src、ErbB2、Raf-1，Akt，Cdk4、Cdk6等)；細(xì)胞膜生長(zhǎng)因子受體(表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR、血小板源性生長(zhǎng)因子受體PDGF-R、胰島素生長(zhǎng)因子受體IGF-R等)；核內(nèi)受體(雌激素受體、雄激素受體)等等。由于這些靶蛋白在腫瘤細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及抗凋亡過程中扮演著舉足輕重的角色，通過抑制Hsp90的功能而清除這些蛋白

3、分子或滅活其激酶活性無疑具有明顯的抗腫瘤優(yōu)勢(shì)。 組蛋白去乙?；敢种苿?histonedeacetylaseinhibitor，HDACi)，是一類高效、低毒的抗腫瘤新藥，具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化及凋亡的作用特點(diǎn)，但對(duì)其抗腫瘤作用機(jī)理迄今為止尚不十分清楚。由于HDACi能增加細(xì)胞核染色質(zhì)上核小體組蛋白的乙?；揎棾潭?，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變?yōu)楦娱_放，從而激活一些基因的轉(zhuǎn)錄，因而人們推測(cè)其抗腫瘤作用與組蛋白乙?；閷?dǎo)的基因活化相

4、關(guān)。但迄今為止，盡管人們采用了包括基因芯片檢測(cè)手段在內(nèi)的各種方法仍無法找出真正與HDACi抗腫瘤作用直接相關(guān)的活化基因，同時(shí)也有實(shí)驗(yàn)表明由HDACi誘導(dǎo)增加的乙?；M蛋白本身與HDACi引起的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制間沒有相關(guān)性，這些結(jié)果使人們開始關(guān)注HDACi抗腫瘤作用的其他可能的機(jī)制。2002年人們首次發(fā)現(xiàn)HDACi可以通過乙?；揎椂绊懩[瘤細(xì)胞中Hsp90的功能，伴隨Hsp90分子的乙?；?，多種Hsp90結(jié)合靶蛋白相應(yīng)被清除從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡

5、發(fā)生。 在Hsp90眾多的底物蛋白中，v-Src是最早發(fā)現(xiàn)的底物蛋白之一，其同源的真核細(xì)胞c-Src做為細(xì)胞內(nèi)一種重要的非受體型酪氨酸激酶，參與并調(diào)控多條與細(xì)胞增殖、抗凋亡相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響著細(xì)胞骨架的構(gòu)建和對(duì)胞外基質(zhì)的粘附。目前的研究表明，HDACi可以誘導(dǎo)Src基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞的分化，但其作用機(jī)制不清。本研究中我們通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立了穩(wěn)定高表達(dá)Src基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型，進(jìn)而以此細(xì)胞為研究對(duì)象，探討了HDACi對(duì)細(xì)胞分化的

6、影響，同時(shí)對(duì)比阻斷型Hsp90抑制劑的作用特點(diǎn)，檢測(cè)了HDACi對(duì)Src激酶表達(dá)及其與Hsp90結(jié)合功能的影響，力圖從全新的角度闡明HDACi誘導(dǎo)細(xì)胞分化的作用機(jī)制。 研究?jī)?nèi)容及結(jié)果： 1.建立高表達(dá)Src基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型 通過真核基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將野生型Src基因?qū)隢IH3T3細(xì)胞，經(jīng)G418加壓篩選，獲得Src穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞模型3T3-Src；3T3-Src細(xì)胞的體外增殖、集落形成、半固體克隆形成及對(duì)胞外基

7、質(zhì)粘附能力與空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞3T3-mock相比均獲得明顯增強(qiáng)。 2.觀察HDAC抑制劑Depsipeptide(DP)誘導(dǎo)3T3-Src細(xì)胞分化的作用 DP可明顯抑制細(xì)胞增殖，阻斷細(xì)胞周期于G0/G1期，并可呈時(shí)間依賴性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。藥物處理后3T3-Src的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生上皮樣改變，免疫熒光染色顯示經(jīng)DP處理24-48h后細(xì)胞骨架排列發(fā)生變化，細(xì)胞分化標(biāo)志之一肌動(dòng)蛋白應(yīng)激纖維(Actinstressfibers)的表達(dá)明

8、顯增強(qiáng)，同時(shí)伴有Gelsolin的水平降低及胞外基質(zhì)粘附能力的改變。蛋白印記檢測(cè)顯示DP可以明顯增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)p21蛋白的表達(dá)水平，增強(qiáng)組蛋白H3的乙?；羌艿鞍譼ubulin的乙?；轿匆娫鰪?qiáng)，提示DP對(duì)HDAC6沒有抑制作用。 3.探討DP對(duì)熱休克蛋白90功能的影響及其誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡的作用機(jī)制以阻斷型Hsp90抑制劑Geldanamycin(GA)為陽性對(duì)照，我們檢測(cè)了DP處理之后不同時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)多種Hsp90底物蛋白

9、水平的變化，結(jié)果表明伴隨Hsp90乙?；潭鹊脑鰪?qiáng)，其底物蛋白R(shí)af-1、Akt及CDK4激酶水平明顯降低，提示Hsp90乙?；呀?jīng)阻斷了其分子伴侶功能。由于Raf-1和Akt蛋白的清除，細(xì)胞內(nèi)重要的ERK及PI3K/AKT信號(hào)通路被阻斷，直接介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在對(duì)Src蛋白的檢測(cè)中我們發(fā)現(xiàn)，DP可以同GA一樣清除內(nèi)源性Src蛋白，但由于HDACi具有活化CMV啟動(dòng)子的特性，伴隨DP的處理，3T3-Src細(xì)胞中外源Src蛋白的表達(dá)獲

10、得明顯增強(qiáng)，同時(shí)伴有增強(qiáng)的Src乙酰化修飾。值得注意的是盡管Src的蛋白水平增加，其與Hsp90間的結(jié)合并不能相應(yīng)獲得增強(qiáng)，伴隨DP的處理，Src蛋白的降解也明顯增加。HDACi可以乙?；疕sp90及其底物蛋白Src現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，提示乙酰化修飾可能同時(shí)影響Hsp90及其底物蛋白分子的構(gòu)象，即Hsp90分子伴侶功能的抑制可能是構(gòu)成該復(fù)合體的分子均發(fā)生乙酰化修飾的結(jié)果。這一發(fā)現(xiàn)有助于更好地闡明HDAC抑制劑阻斷Hsp90功能的作用機(jī)制，具有重

11、要的意義。DP通過抑制Hsp90的分子伴侶功能清除Src蛋白，可能是DP誘導(dǎo)Src基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化的主要作用機(jī)制。 結(jié)論：1.HDAC抑制劑DP可以誘導(dǎo)Src基因轉(zhuǎn)染的3T3-Src細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞分化，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞形態(tài)和粘附特性發(fā)生改變。 2.DP可以通過增強(qiáng)Hsp90的乙?；黠@阻斷Hsp90的分子伴侶功能，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)多種Hsp90底物蛋白如c-Src，Raf-1，Akt及CDK4激酶等被清除，這些底