熱休克蛋白90抑制劑BIIB021對慢性粒細胞白血病作用及其機制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述
　　第一部分:BⅡB021對CML細胞株抑制生長、誘導凋亡的作用及其機制
　　目的:研究BⅡB021對CML細胞株抑制生長和誘導凋亡的作用，并探索BⅡB021誘導CML凋亡的分子機制。
　　方法:MTT法檢測BⅡB021對CML細胞株生長抑制的作用，AV/PI流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，Western-blot法檢測Caspase-3、Caspase-9和PARP蛋白的表達變化。Wester

2、n-blot法檢測線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達變化。Real-Time PCR檢測BⅡB021作用后BCR-ABL mRNA水平，Western-blot法檢測BCR-ABL蛋白水平及其下游的Jak/Stat通路、Akt/mTOR通路、Erk通路以及β-Catenin/c-Myc通路的蛋白表達量變化。激光共聚焦檢測BⅡB021作用后β-Catenin表達量的變化。
　　結(jié)果:(1)BⅡB021能顯著抑制CML細胞株K562、K562/G

3、、32Dp210、32Dp210-T315I增殖，呈時間和濃度梯度依賴，48小時IC50分別是:513.99、603.53、110.08、148.07 nmol/L。(2)BⅡB021作用24小時后能明顯誘導CML細胞發(fā)生凋亡。Caspase-3、Caspase-9和PARP激活，Bak、Bad的蛋白表達量增加，Bid、Mcl-1、Survivin表達量減少，Bcl-2、Bcl-XL、Bax不變。(3)BⅡB021能在蛋白水平抑制BCR

4、-ABL和p-BCR-ABL的表達，而在mRNA水平?jīng)]有減少，蛋白酶體抑制劑MG-132能逆轉(zhuǎn)BⅡB021誘導的BCR-ABL下降，而自噬溶酶體抑制劑氯喹則不能。(4) BⅡB021能在蛋白水平下調(diào)磷酸化的Stat3、Stat5、Erk1/2，下調(diào)總的Jak2和Akt。(5)BⅡB021能下調(diào)β-catenin/c-Myc通路的蛋白表達量。激光共聚焦顯微鏡觀察及分別提取胞核、胞漿蛋白，均顯示BⅡB021能同時減少胞核和胞漿中的β-cat

5、enin。
　　第二部分: BⅡB021對CML細胞株誘導自噬的作用及其機制
　　目的:研究BⅡB021誘導CML細胞發(fā)生自噬及其分子機制，探討B(tài)ⅡB021誘導的自噬在凋亡中的作用，與自噬抑制劑聯(lián)合應用，為臨床CML治療提供新的方案。
　　方法:Monodansylcadaverine染色、吖啶橙染色后熒光顯微鏡觀察嗜酸性小體。用攜帶mRFP-GFP標記LC3的腺病毒轉(zhuǎn)染細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察自噬小體。Wester

6、n-blot法檢測LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、Beclin-1，mTOR-Ulk1通路蛋白水平變化。MTT法檢測生長抑制作用。用攜帶shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染細胞沉默Caspase-3。采用SPSS20統(tǒng)計處理軟件分析，以p＜0.05作為有差別統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:(1)BⅡB021誘導CML細胞產(chǎn)生自噬小體。(2)BⅡB021促進LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，減少p62和Beclin-1的表達量。(3)BⅡB021通過Akt-mTOR-Ulk

7、1通路誘導自噬。(4)BⅡB021與自噬抑制劑3-methyladenine或bafilomycinA1聯(lián)合應用后顯著增加BⅡB021誘導的CML細胞凋亡，證明BⅡB021誘導保護性自噬。
　　結(jié)論:通過一系列體外實驗，證明小分子抑制劑BⅡB021具有抗慢性粒細胞白血病的作用。它能激活線粒體通路誘導凋亡，并且對伊馬替尼耐藥株，特別是32Dp210-T315I也有明顯誘導凋亡的作用。BⅡB021主要通過蛋白酶體途經(jīng)誘導BCR-ABL