Bad基因的克隆、表達(dá)及其對(duì)人基底細(xì)胞癌A431細(xì)胞促凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、基底細(xì)胞癌(basalcellcarcinoma，BCC)，又稱(chēng)基底細(xì)胞上皮瘤，是顏面部皮膚最常見(jiàn)的惡性上皮性腫瘤，以面中部多見(jiàn)。本病發(fā)展緩慢，很少發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療主要采用外科切除的方法，但手術(shù)治療后遺留的面部畸形將給患者帶來(lái)沉重的心理負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響患者的術(shù)后生存質(zhì)量。近年來(lái)，基底細(xì)胞癌的發(fā)病率逐漸升高，引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，由于癌基因激活或抑癌基因失活導(dǎo)致的細(xì)胞周期失控，細(xì)胞凋亡不足，是許多腫瘤發(fā)生的重要機(jī)

2、制。近年來(lái)，隨著人們對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制進(jìn)一步深入的了解，越來(lái)越多的研究者試圖通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)治療癌癥，并取得了初步成效?；蛑委?，就是將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞中，使其在患者體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的的方法?；蛑委熥鳛橐环N新的腫瘤治療手段越來(lái)越引起醫(yī)學(xué)界的重視。 Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)分子，包括Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad、Bak、Bag-1、Bik、Bok、Bim、GRS、Bfl-1、Hrk

3、、Al、Mcl-1、BHRF-1等，目前還不斷有新基因被發(fā)現(xiàn)。該家族成員的共同特點(diǎn)是由4個(gè)保守序列BH1、BH2、BH3和BH4，這些保守序列對(duì)于Bcl-2家族成員間的結(jié)合與發(fā)揮各自的作用極為重要，其中BH1和BH2對(duì)于抗凋亡蛋白如Bcl-2的結(jié)合能力及抗凋亡作用很重要，而B(niǎo)H3對(duì)于凋亡蛋白Bax和Bak等至關(guān)重要。另外，Bcl-2家族蛋白的C端都含有一段疏水氨基酸鏈，使其能與細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合。它們可形成同源或異源二聚體，其中一些誘導(dǎo)凋亡，

4、另一些阻止凋亡發(fā)生，如Bcl-2亞家族(包括Bcl-2、Bcl-xl等)，能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而B(niǎo)ax亞家族(如Bax、Bak等)，和BH3亞家族(Bad、Bid等)則促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Bad(Bcl-2-antagonistofcelldeath)1995年被發(fā)現(xiàn)，編碼168個(gè)氨基酸，與Bcl-2家族的同源性較低，在凋亡過(guò)程中，表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在凋亡過(guò)程中，Bad依靠自身的強(qiáng)結(jié)合力，以濃度依賴(lài)性的方式替換Bcl-2/Bax、Bc

5、l-xl/Bax異二聚體中的Bax，使Bax游離后形成同源二聚體而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 本研究根據(jù)GenBank中Bad基因序列設(shè)計(jì)引物，在上下游引物中分別引入XhoI和EcoRI的酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增包括目的基因的序列，利用酶切連接使目的基因正確插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1-myc、pEGFP-C3，進(jìn)行酶切鑒定和基因測(cè)序，表明序列與GenBank報(bào)道完全一致，成功構(gòu)建了Bad真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1-myc-Bad、pEGF

6、P-C3-Bad。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞系，體外實(shí)驗(yàn)觀察該基因?qū)431細(xì)胞的促凋亡作用。分別以重組載體pcDNA3.1-myc-Bad和pEGFP-C3-Bad、空載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞，可觀察到目的基因的表達(dá)。間接免疫熒光可觀察到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞死亡增多，并出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)的改變。細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察到實(shí)驗(yàn)組存活細(xì)胞數(shù)目減少。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，觀察到實(shí)驗(yàn)組早期凋亡率較空載體組明顯增高，表明Bad基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)A431細(xì)胞具有促凋