HIV Vpr穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立及其促細(xì)胞凋亡作用的研究.pdf

1、目的：HIV vpr基因產(chǎn)生的Vpr蛋白在HIV感染宿主細(xì)胞的過程和AIDS的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。它參與病毒整合前復(fù)合體的核轉(zhuǎn)運，激活病毒的轉(zhuǎn)錄過程，誘導(dǎo)細(xì)胞周期的G2／M期停滯，促進(jìn)感染細(xì)胞凋亡。在一些感染者中，HIV vpr基因的變異導(dǎo)致其功能的部分或全部喪失與疾病進(jìn)展緩慢有關(guān)。本研究以攜帶野生株HIV vpr基因和突變株HIV vpr-FS基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)HIV-Vpr蛋白的細(xì)胞株，旨在研究Vpr蛋白促進(jìn)

2、感染細(xì)胞凋亡的特性，以及Vpr變異后對其致凋亡作用的影響，探討HIV vpr的致病機(jī)制，并為進(jìn)一步的實驗研究打下基礎(chǔ)。 方法：目的基因vpr和vpr-FS來自BSXCYPYVPRXCTHY質(zhì)粒和BSXCYPYVPRXCTHY(FS)質(zhì)粒。分別將目的基因連入pcDNA3.1真核表達(dá)載體，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3.1 vpr。和pcDNA3.1 vpr-FS。將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶酶切，及送質(zhì)粒DNA測序以鑒定vpr及vpr-

3、FS的一級結(jié)構(gòu)。將重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，用含G418的培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)后，RT-PCR檢測目的基因mRNA水平的表達(dá)，Western印跡檢測蛋白水平的表達(dá)。用As<,2>O<,3>誘導(dǎo)Hela pcDNA vpr細(xì)胞和HelapcDNA vpr-FS細(xì)胞凋亡，并用轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的Hela pcDNA3.1細(xì)胞作為對照。用流式細(xì)胞術(shù)檢測DNA含量及凋亡細(xì)胞百分率：DNA瓊脂糖電泳法觀察DNA斷裂。

4、結(jié)果：重組質(zhì)粒pcDNA3.1vpr和pcDNA3.1 vpr-FS經(jīng)酶切后均可獲得342bp產(chǎn)物，初步證實插入vpr和vpr-FS片斷與理論預(yù)計大小一致，DNA測序結(jié)果也與目的基因已知序列完全一致：將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，并經(jīng)G418選擇培養(yǎng)后，RT-PCR檢測到目的基因vpr或vpr-FS的表達(dá)，Western印跡檢測到明顯Vpr或Vpr-FS蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞儀和細(xì)胞內(nèi)DNA片斷分析法分別檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Hel